Частная биотехнология антибиотиков
Производство пенициллинов
В 1871 г. В .А. Манасеиным было установлено, что зеленая плесеньPenicillium glaucum при своем росте уничтожает бактерии, попадающиев культуральную среду. Это свойство Penicillium было тогда же использовано врачом А. Г. Полотебневым, применившим смоченные этой плесенью повязки при лечении гнойных ран и язв.
Выдающееся открытие русских ученых не получило широкой известности, и в 1928 г. англичанин Александр Флеминг вторично обнаружил 2жспособность плесневого грибка Penicillium угнетать рост микроорганизмов. Было показано, что вызываемая плесенью гибель микробовобусловлена образованием неизвестного органического вещества, на-званного пенициллином. Однако выделение пенициллина в чистом видев то же время осуществлено не было, так как он оказался веществомочень лабильным, а применявшиеся методы очистки были несовершенны.
В годы Второй мировой войны огромная практическая потребностьв эффективных антибактериальных препаратах привлекла к пенициллину внимание широкого круга специалистов, и примерно с 1939 г. начался период интенсивных исследований. Благодаря этому в относительнокороткий срок (3–5 лет) англичанами Х. Флори и А. Чэттеном были разработаны способы промышленного получения и очистки пенициллина,изучены его лечебные свойства и методы клинического применения, атакже установлена его химическая структура.
Для практических целей медицины пенициллин получают в промышленности путем биосинтеза. Процесс биосинтеза складывается изследующих стадий: 1) выращивания посевного материала (микроорганизмов) в аппаратах малой емкости – инокуляторах; 2) выращиванияпосевного материала в больших посевных аппаратах; 3) процесса ферментации; 4) выделения антибиотика из культуральной жидкости и егоочистки.
|
|
|
Важное значение имеет также селекционный подбор высокопроизводительных штаммов плесени, подготовка и стерилизация питательнойсреды и аппаратуры.
Очень важное значение для высокого выхода пенициллина имеетпитательная среда, примерный состав которой (в %) следующий:
Кукурузный настой – 3 (по объему)
Сульфат цинка – следы
Лактоза (или глюкоза) – 2 (по весу)
Карбонат кальция – 0,25
Нитрат натрия – 0,6
Магний сернокислый гептагидрат –0,05
Калий фосфорнокислый (однозамещенный) – 0,15
Вода ~ 90
Вместо какурузного настоя успешно применяется мука из хлопковых семян или мясные гидролизаты.
Приготовленную питательную среду подвергают стерилизации.Процесс ведут в колоннах непрерывного действия. Далее питательнаясреда поступает в аппарат-выдерживатель, где охлаждается в течениеопределенного времени до температуры 23–25 оС.
|
|
|
Первая стадия процесса – выращивание стандартной колонииштаммов плесени Penicillium chrysogenum – проводится в инокуляторахна питательной среде, где процесс идет ~30 часов. Подготовленныйинокулят передают в посевной аппарат, объем которого ~ в 10 разбольше объема инокулятора. В посевном аппарате находится также стерилизованная питательная среда. Процесс роста здесь идет ~15–20 часов, и далее посевной материал передается на ферментацию в большиереакторы – ферментаторы объемом до 100 м3 на питательную среду.Процесс ферментации идет ~70 часов при температуре 23–24 оС, рНсреды 6–6,5 и постоянной аэрации воздуха – 1 л воздуха/1 литр питательной среды/1 мин по всему объему ферментатора.
Основная задача этого процесса – создание оптимальных условийдля развития продуцента и накопления антибиотика. Биосинтез антибиотика – двухфазный процесс. В течение первой фазы происходит быстрый рост и размножение мицелия или бактериальных клеток. Культуральная жидкость в этот период богата углеводами, азотом и неорганическим фосфором. Продукты обмена веществ микроорганизмов, в томчисле и антибиотики, находятся в малых количествах.
Вторая фаза начинается с момента замедления роста культуры.Протекает она в культуральной жидкости, обогащенной продуктомжизнедеятельности организма с небольшим количеством углеводов ифосфора. В начале этой фазы мицелий обладает максимальной способностью к синтезу антибиотика. Фазы отличаются характером и интенсивностью биохимических реакций. С учетом этих различий подбираютусловия, благоприятные для первой и второй фаз развития продуцента.
|
|
|
Для увеличения выхода антибиотика в питательную среду вводят«предшественники», т. е. химические вещества, способствующие целенаправленному синтезу антибиотика. Так, в питательную среду прибиосинтезе пенициллина вводят «предшественник» фенилацетамид –это увеличивает выход антибиотика более чем в 2 раза.
По окончании процесса ферментации культуральную массу передают на процесс выделения антибиотика.
Большинство продуцентов при биосинтезе выделяют антибиотик вводную фазу, поэтому процесс выделения антибиотика начинается сразделения твердой и жидкой фаз.
Твердая фаза, кроме массы мицелия, содержит значительное количество коллоидных примесей, затрудняющих фильтрование, поэтомукультуральную массу предварительно подвергают различным типамкоагуляции (электролитической, тепловой, кислотной и т. д.). Наиболееэффективным методом коагуляции культуральной массы является ееобработка флокулянтами (высокомолекулярными полиэлектролитами),например, поли-(4-винил)-N-бензилтриметиламмонийхлоридом. Оставшийся от фильтрации мицелия водный раствор антибиотика направляют на химическую очистку и выделение. Таким образом, водный раствор пенициллина направляют после фильтрации на экстракцию бутилацетатом при рН водной среды, равной 2. При таком значении кислотности среды подавляет кислотная ионизация пенициллина в водной фазе и он переходит в органическую фазу (в бутилацетат). Реэкстракциюпенициллина из бутилацетата проводят слабыми растворами щелочей.
|
|
|
Широко применяются сорбционные методы выделения и очисткиантибиотиков. В качестве сорбентов широко используются синтетические ионообменные смолы.
Сушат пенициллины методом сублимации или распыления.
Угроза резистентности. Успехи применения бензилпенициллина в лечении болезней, вызванных различными бактериями, были поистине сенсационными. Чувствительными к нему оказались и стафилококки, являющиеся возбудителями очень серьезных заболеваний. Статистические данные показывают, что в 1944 г. число инфекционных больных, вылеченных бензилпенициллином, было около 99,8 %, однако, уже в 1956 г. этот процентснизился до 65 %, особенно большой процент инфицированных больных, не поддававшихся лечению бензилпенициллином, наблюдался среди работников предприятий, производящих антибиотики, и работниковхирургических клиник, широко использующих антибиотики для лечения больных.
Почему же именно эти заведения стали рассадниками болезнетворных организмов, устойчивых к действию пенициллина? Уже со временипервого применения пенициллина стало известно, что некоторые стафилококки невосприимчивы к нему. Чувствительные к пенициллинуштаммы стафилококков погибают при лечении, остаются резистентныестафилококки, которые начинают размножаться и заполнять опустевшую нишу. И, таким образом, применение пенициллина для лечения заболеваний, вызванных резистентными формами стафилококка, не приведет к положительному результату.
Каким же путем избегают гибели стафилококки, резистентные кпенициллину? Было установлено, что они способны обезвредить молекулу пенициллина, изменив его структуру в самом слабом месте. Устойчивые стафилококки вырабатывают фермент, который может разрушитьмолекулу пенициллина при добавлении к ней молекулы воды. При этомпроцессе (гидролизе) образуется соединение, безвредное для микробов.
Фермент, способствующий реакции «обезвреживания», называетсяпенициллиназой. Его возникновение вызывается присутствием в средепенициллина. С 1969 г. стала известна и химическая структура пенициллиназы, вырабатываемой стафилококками. В построении ее молекулы участвуют 257 структурных единиц двадцати аминокислот, соединенных в различной последовательности.
Другие бактерии образуют ферменты (ацилазы), которые разрывают связь между основным ядром молекулы бензилпеницилина и ее боковой ацильной группой, образуя биологически неактивную 6-аминопеницилановую кислоту
Второе расщепление ученые стали использовать для своих целейкак возможность изменить молекулу пенициллина таким образом, чтобы ацилаза не смогла подвергнуть ее гидролизу. Таким способом былиполучены новые полусинтетические пенициллины.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 644; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!