Методы культивирования продуцентов антибиотиков
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов–продуцентов антибиотиков признан методглубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизмразвивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно подается стерильный воздух, и среда перемешивается.
Существует четыре основных модификации глубинного способавыращивания микроорганизмов.
1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процессразвития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежейпитательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, ипроцесс возобновляется.
2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня.
3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость наопределенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.
|
|
|
4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принципнепрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживатьразвитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадияразвития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически
активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошиерезультаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареиподдерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большуюскорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате – обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования – перспективное направление современной биотехнологии.
Стерилизация питательных сред
Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. Среда должна соответствовать определеннымтребованиям:
а) обеспечивать максимальный выход антибиотика;
б) состоять из относительно дешевых компонентов;
|
|
|
в) иметь хорошую фильтрующую способность;
г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков.
Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя методами: периодическим и непрерывным.
Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается дотемпературы 120–130оС непосредственно в ферментаторах или в специальных котлах–стерилизаторах, выдерживается при этой температуре втечение 30–60 минут (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27–30оС.За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, уничтожается значительноечисло микроорганизмов. Эффект стерилизации и сохранение термолабильных веществ достигаются в том случае, если стерилизацию проводят при более высокой температуре и за более короткое время.
Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять прииспользовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускают острый пар (давление пара около 505Па). Пар подают сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидныепрорези, благодаря чему он поступает в среду, быстро ее нагревая. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутреннейтрубы.Среда, нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (~130 оС), поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125–130 оС. Время выдержки зависит от состава среды и длится 5–10 минут. Отсюда стерильнаясреда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30–35 оС(на выходе) и поступает в ферментатор.
|
|
|
Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды идр.
Подготовка посевного материала
Подготовкапосевного материала – одна из ответственейших операций в цикле биотехнологического способа получения антибиотиков. Отколичества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментаторе, так и биосинтез антибиотика. Продуцент обычновыращивают на богатых по составу натуральных средах, способныхобеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов.
|
|
|
Подготовка посевного материала – процесс многоступенчатый (рис.1).
Рис. 1. Схема многоступенчатого приготовления посевного материала
А – выращивание во флаконах, Б – в колбах на качалках:1 – законсервированный исходный материал; 2 – споровая генерация на косом агарев пробирке; 3 – II споровая генерация на твердой среде в сосуде; 3а и 3б – I и III генерации на жидкой среде в колбе; 4 – ферментатор предварительного инокулирования; 5 – ферментатор инокулирования; 6 – основной ферментатор
Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованнойсреде в пробирке (1, 2), затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение двух–трех суток для каждой генерации(3а и 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культурупереносят в более крупный инокулятор 5 (100–500 л), откуда и делаютпосев в основной ферментатор 6. Для посева в основной ферментаториспользуют от 5 до 10 % посевного материала (инокулята).
Развитие продуцента антибиотика в ферментаторах
Развитие микроорганизма в ферментаторах проходит при строгомконтроле всех его стадий и очень точном выполнении регламента условий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды (рН), степениаэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляют биологический контроль, учитывают потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источника углерода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиотика. В последнее время все чаще биологический контроль проводят с помощью ЭВМ.
Условия ферментации.
Рис.1.
- в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемыеисточники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов –например, крахмал.
- в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку;
- должна быть небольшая концентрация фосфора.
Любые предшественники для получения антибиотической структуры надодобавлять не в «0» точке ферментации, а на 2-е, 3-и сутки (если продуцент –грибы или актиномицеты), когда антибиотики начинают синтезироваться (этоотносится, например, и к фенилуксусной кислоте (ФУК) при синтезепенициллина, которую добавляют на вторые или третьи сутки биосинтезапенициллина).
Предшественники β-лактамных антибиотиков.β-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L -валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD-трипептид (L –валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептидаобразуется лактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащеекольцо и т.д. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза.
Аминогликозиды синтезируются из глюкозы.
Тетрациклины и макролиды синтезируются с помощью ацетилкоэнзимаА(Ац-КоА) наподобие жирных кислот (с участием приблизительно 22-хферментов).Ферменты синтезирующие антибиотики образуют мультиферментныекомплексы (за счет водородных связей), в которые «входят»предшественники антибиотика, а «выходит» целая молекула антибиотика (вовнешнюю среду). Эти комплексы располагаются по периферии клеткипродуцента. Таким образом, антибиотики отделяются от других систем
синтеза в клетке, и антибиотик никак не воздействует на свой продуцент (неингибирует и не активирует другие процессы). К тому же мембраныпродуцента непроницаемы для вышедшего продуцента, тем самым создаваяусловия одностороннего движения антибиотика только во внешнюю среду.
Большое внимание при развитии продуцента в ферментаторах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма образуется обильная пена, которая существеннонарушает процесс развития продуцента антибиотика в ферментаторе.
Появление большого количества пены обусловлено белковыми веществами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано собильным накоплением биомассы.Для борьбы с пеной в ферментаторах используют поверхностноактивные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко вкачестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутананкарбамил и др.).
Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков какдополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности.
Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пенысильными струями жидкости, пара или газа).
Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения ихимической очистки представлена на рис. 2.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1674; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!