Принцип радиоиммунного анализа (РИА)
Вначале инсулин метят радиоактивным иодом I 125.Затем берут определенное количество антител к инсулину в определенномобъеме сыворотки и добавляют их к пробе крови (предварительно разведенной),в которой содержится немеченый (нерадиоактивный) инсулин из организмачеловека. Комплекс антигена (АГ) инсулин+ антитело (АТ) выпадает в осадок.Затем в эту же пробирку добавляют инсулин меченный радиоактивным иодом. Вэтом случае, оставшиеся после реакции с нерадиоактивным инсулином, антителареагируют уже с радиоактивным инсулином и образующийся комплекс такжевыпадает в осадок. Полученный таким образом общий осадок отделяют отреакционной смеси и определяют в нем радиоактивность. Закономерностьполучается такая: чем меньше инсулина в крови человека, тем больше свяжетсямеченого инсулина с антителами (так как останется больше непрореагировавших антител) и соответственно тем больше будетрадиоактивность. Этот метод позволяет определить инсулин в концентрации 10 - 9 -10 -12 грамм на миллилитр (г/мл). Этот метод позволяет определить меченыйинсулин независимо от любых примесей, которые могли бы исказить результат
анализа.
Что необходимо иметь для проведения такого анализа?
В специальном наборе должны быть
-антитела к инсулину (эти антитела находятся в сыворотке лабораторныхживотных),
- проба крови с инсулином от испытуемого,
- оборудование для отделения осадка в котором можно измеритьрадиоактивность,
|
|
|
- счетчик ГСБ-1.
Если в целом представить себе схему этого анализа, то она выглядит следующимобразом:
Рис.3
Биосинтез соматотропина и других гормонов человека
Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в головном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был выделен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке соматотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек. Гормон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной карликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Исследования показали, что при внутримышечном введении соматотропина в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8–18 см в год. Больные дети четырех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверстников к половой зрелости (14–16 лет).Если учесть тот факт, что из одного трупа можно получить 4–6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином – дело совершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и другие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала. Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.
|
|
|
Гормон роста человека, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.
Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе кишечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образованием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 этапе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.
|
|
|
К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и тесты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадеживающими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.
b-эндорфин.Еще один гормон, b-эндорфин – опиат мозга, состоящий из 31-йаминокислоты, – был синтезирован в генетически сконструированныхклетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн иамериканские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировалиДНК, кодирующую b-эндорфин, в клетках E. сoli и получили этот полипептид в виде слитного белка с ферментом b-галактозидазой. На первомэтапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обратной транскрипции и-РНК, кодирующей b-эндорфин, и далее встраивалиего в плазмиду E .coli за геном b-галактозидазы, при этом получили гибридный белок, состоящий из b-галактозидазы и b-эндорфина; далееферментативно отщепляли b-галактозидазу, получая биологически активный b-эндорфин.
|
|
|
Эритропоэтин.Эритропоэтин – гормон гликопротеиновой природы, стимулирующий пролифрацию и дифференцировку эритропоэтин-чувствительных клеток в морфологически распознаваемые эритробласты. Это полипептид, состоящий из 165 аминокислот с м.м. 30400. Эндогенный эритропоэтин выделяется в почках в ответ на тканевую гипоксию. При анемии индукция эритропоэтина повышена, что стимулирует образование эритроцитов в костном мозге и проводит к коррекции анемии. Эритропоэтин показан больным с почечной недостаточностю и выраженной анемией. Он павышает уровень гемоглобина, эритропоэтин полезен при СПИДе и раке. эритропоэтин выделен первым из всех гемопоэтических факторов (впервые получен из мочи тяжело больных анемией). Получение значительных количеств эритропоэтина из природных источников практически невозможен из-за низкого содержания его в сырье. С использованием генно-инженерной технологии в культуре клеток млекопитающих (штамм СНО) получают рекомбинантный человеческий эритропоэтин. Производство основано на комбинации аффинной и ионно-обменной хроматографии и позволяет получать практически гомогенный, мономерный полностью активный белок, не содержащий значительных примесей. Уже много лет получаемый по новой технологии эритропоэтин является ведущим продуктом предприятия Amgen Калифорния.
Эритропоэин относится к четырем генно-инженерным препаратам, производимым в России. В частности, НПО «Микроген» выпускает «Эритростим», представляющий высокоочищенный (95,5%) рекомбинантный эритропоэтин человека с сывороточным альбумином в виде раствора на изотоническом цитратном буфере.
Получение интерферонов
Еще одним замечательным достижением генной инженерии является синтез интерферона.Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, которыйвыделяется в очень низких количествах клетками животных и человекапри попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ними. Первые же исследования выявили высокую биологическую активность интерферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых заболеваний(подавляет размножение аномальных клеток). Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны животныхнеактивны в организме человека и даже отторгаются им.
Интерфероны – группа белковых веществ, вырабатываемых клетками,зараженными вирусами. Интерфероны индуцируют противовирусные реакции
В организме человека вырабатывается несколько видов интерферонов:
α-группа b-группа g-группа
лейкоцитарный интерфероны иммунный интерферон
интерферон фибробластов Т-лимфоциты
Природные интерфероны получают из крови человека с крайненизким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохраненияв Хельсинки (в то время мировой лидер в получении лейкоцитарногоинтерферона) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0,1г чистогоинтерферона.
Процесс получения интерферонов в основных чертах был одинаковдля всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч фильтровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографическойочистке. Стоимость препарата была очень велика – 400 г интерферонастоил 2,2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологическогоего использования (в том числе против четырех видов рака) заставлялаискать новые пути его получения, в первую очередь с помощью геннойинженерии.
В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетическисконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудностьпри этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало даже в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, чтовыходы были очень низкие: сообщалось о получении 1–2 молекул интерферона на одну бактериальную клетку. В 1981 г. фирме «Генентек»удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую g–интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки млекопитающих, и они стали способными синтезировать интерферон сбольшим выходом – 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1млн единиц интерферона (единица интерферона соответствует такому его количеству, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения вирусом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователивыделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили молекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далеебыли отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.
Список использованной литературы:
1. Биотехнология. Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева – М.: «Академия», 2007 г. – 215 с.
2. Егорова Т. А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 208 с.
3. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Курс лекций по биотехнологии / ММА им. И.М. Сеченова, 2005 г. – 150 с.
4. Османов В.К., Лекции по биотехнологии/Ниж ГМА, 2008 г. – 250 с.
5. Основы фармацевтической биотехнологии, Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова – Ростов н/Д.: Феникс, 2006 г. – 180 с.
6. Тимощенко Л.В., Чубик М. В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие /Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с.
7. Фармацевтическая биотехнология: учеб. пособие / В.А. Быков (и другие) под общ. редакцией акад. РАМН и РАСНХ, профессора В.А. Быкова – Воронеж: издательство Воронеж. гос. ун-та, 2009. – 439 с.
Интернет ресурсы:
8. www.biotechnolog.ru
9. Биотехнология: генная инженерия, промышленная биотехнология, клеточная инженерия – учебное пособие: [электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www. biotechnolog.ru
10. Биоинформатика, геномика, протеомика. биософт, имейджинг: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.bioinFormatix.ru
11. Интернет журнал «Коммерческая биотехнология»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.cbio.ru
12. Общество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.biorosinfo.ru Remedium.ru:
13. Профессионально о медицине и фармации [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.remedium.ru
14. Новости GMP – Стандарт GMP – Фармацевтические производства и технологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа http://www.gmpnews.ru
15. Ассоциация Российских фармацевтических производителей [Электронный ресурс]. – Режим доступа http://www.arfp.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Лекция №6
Тема лекции:Биотехнология витаминов. Производство аминокислот.
Ф.И.О. ассистента: Караева А.М.
по предметубиотехнология
факультет фармация
курс IV, VIII семестр
Лекция №6
Тема лекции:Биотехнология витаминов. Производство аминокислот.
Цель лекции:Изучить методы получения витаминов и аминокислот, особенности культивирования штаммов-продуцентов и развитие биотехнологии в получении витаминных препаратов методом генной инженерии.
План лекции:
1. Значение витаминов для человека. Источники витаминов
3. Получение водорастворимых витаминов
4. Получение жирорастворимых витаминов. Убихиноны
5. Методы получения аминокислот
6. Перспективы развития биотехнологии в получении витаминныхпрепаратов.
Оснащение лекции: презентация
Место проведения: аудитория 525
Первичные метаболиты – низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микробов: одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие – участвуют в синтезе коферментов.
Среди наиболее важных для промышленности первичных метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, нуклеотиды и витамины.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 698; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!