Спектр биотехнологического производства рекомбинантных белков
Биотехнология рекомбинантных белков охватывает производство:
• гормонов (инсулина)
• вакцин (против гепатита В)
• пептидных факторов роста тканей
• рекомбинантных интерферонов (они представляют неспецифическуюзащиту клетки от вирусов и злокачественных образований).
На первом месте среди них по значению стоит рекомбинантный инсулин,составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.В проблеме производства рекомбинантных белков очень важно, чтобыиспользуемые в этом случае микроорганизмы, в которые вносят чужеродныегены, удовлетворяли бы следующим свойствам:
1. Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому вкачестве продуцентов рекомбинантных белков используют именнотакиемикроорганизмы: этоEscherichiacoli, Bacillussubtilis,Saccharomyces cerevisie.
2. Микроорганизмы должны быть не патогенны.
3. Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться вусловиях ферментера.
4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделятьсекретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, есливвести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантныйбелок с дополнительной аминокислотной последовательностью,состоящий из гидрофобных аминокислот. Роль гидрофобныхаминокислот состоит в том, что они перетаскивают белок в липиднуюмембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальныхпротеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуетсянужный целевой продукт – это рекомбинантный белок, выходящий всреду.
|
|
|
5. Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмовкомпетентными для того, чтобы их клеточная стенка была быпроницаема для плазмид.
Правила безопасности при работе с рекомбинантными микроорганизмами:
1. Системы выброса оснащаются фильтрами, задерживающими микробныеклетки.
2. После завершения процесса производится стерилизация оборудования, ноне должно быть разъедания материалов (коррозия), из которыхизготовлено оборудование.
3. В ферментере понижается давление на несколько миллиметров ртутногостолба.
4. В клетку продуцента вставляется генетический дефект. Дефектзаключается в том, что стираются несколько генов путем делеции, то естьизбирательно удаляют гены, продуцирующие какую либо аминокислотуили фермент, синтезирующий витамин. Микроорганизм становится болеекапризным и уязвимым в случае изменения этой среды и соответственноне жизнеспособным.
В среде должна быть обязательно для нормального функционированиямикроорганизма именно эта аминокислота или витамин, иначемикроорганизм размножаться не будет и мы не будем иметь целевойпродукт.
|
|
|
Промышленное производство рекомбинантного инсулина
Инсулин – это белок, который является гормоном поджелудочнойжелезы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводови проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемическийэффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переходглюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активированиепутем образования глюкозо-6-фосфата. Последний, окисляясь, обеспечивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует периферическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит распад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распадажиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активирование синтеза жиров и белков. При недостатке инсулина развиваетсятяжелое заболевание – диабет; при этом разрушается нормальный обмен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, еслиэтого не происходит, то развивается тяжелое состояние – диабетическаякома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгоевремя источником инсулина служили железы коров и свиней. Учитывая, что поджелудочная железа коровы весит 200–250 г, для получения100 г кристаллического инсулина нужно 800–1000 кг исходного сырья.
|
|
|
Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, только 4млн получали препарат инсулина.
Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. Ворганизме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангергансаподжелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развиваетсятакое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа).
При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваютсяпатологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает придефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы вклетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарныйдиабет.
Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина.
Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:
А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.
В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков
Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечиваютпространственную структуру белка инсулина.
При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуетсяпредшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулинсостоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотныхостатков.
|
|
|
С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина ипроинсулин переходит в активный инсулин.
Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на полученииинсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.
Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.
До внедрения в промышленность метода получения инсулина сиспользованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только одинспособ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скотаи свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатогоскота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин,получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то естьон ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков,отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительномвыражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин,как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови
образующимися антителами.
Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч головсвиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата).С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое жеколичесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используярекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.
Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-хгодов
(восьмидесятых годов).
Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):
1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательностинуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть былисозданы синтетические гены.
2. этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в однуплазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводятген, синтезирующий цепь В).
3. этап. Вводят ген, кодирующий образование ферментабетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,чтобы добиться бурной репликации плазмид.
4. этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочкииполучают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь,вторая В-цепь.
5. этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляютгалактозу, которая индуцирует образование ферментабетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются,образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,
синтезирующих А и В цепи.
6. этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны сбетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляютА и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшуюочистку и выделение А и В цепей.
7. этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получаютинсулин.
Рис.2
Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своейструктуре. Применение современных методов очистки исключает наличие винсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.Контроль концентрации инсулина в крови человека
1. Определение концентрации глюкозы в крови человека
2. Применение метода радиоиммунного анализа (РИА).
Остановимся на применении радиоиммунного анализа. Для его проведениянеобходим специальный набор реагентов и счетчиков.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1518; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!