ПОЛИМЕРНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ.САУЗЕРН-БЛОТ И НОЗЕРН-БЛОТ АНАЛИЗЫ.



Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — процесс амплификации, который осуществляют в пробирке. Фрагмент ДНК или РНК, подлежащий амплификации, помещают в пробирку и добавляют два коротких олигонуклеотидных праймера (химически синтезированные одноцепочечные фрагменты ДНК). Праймеры инициируют процесс амплификации, продолжающийся в виде серии циклов, в которых исходная ДНК, называемая матрицей, разделяется на отдельные цепи. При разделении молекулы ДНК на две цепи происходит связывание, или отжиг, праймеров с соответствующими фрагментами, несущими комплементарные последовательности на другом конце одноцепочечной ДНК. Устойчивый к действию высоких температур фермент ДНК-иолимераза присоединяет нуклеотидные основания к концам каждого праймера, прочитывая последовательность одноцепочечной ДНК и образуя комплементарную ей копию. Когда полимераза достигает конца одной цепи, формируется новая двухцепочечная ДНК, и начинается новый цикл, включающий нагревание и разделение двойной спирали (денатурация молекулы ДНК) с последующим отжигом праймеров и наращиванием повой цепи ДНК-полимеразой. Каждый цикл амплификации в ходе полимеразной цепной реакции удваивает количество ДНК-матриц. С помощью ПЦР можно получить миллионы копий того или иного фрагмента ДНК всего за несколько часов, даже если исходно была только одна молекула ДНК. Полная амплификация выполняется в плотно закрытых пробирках или лунках специальных плашек на приборе, в котором имеется автоматизированная программа нагревания и охлаждения образна. В настоящее время ПЦР стала обычным инструментом получения достаточного количества идентичного генетического материала для исследований и анализов.

Метод Саузерн-блот Для анализа генов необходимо определить локализа- цию сайтов рестрикции. Эта информация используется для сравнения гомологичных генов разных видов, для анализа организации интронов, для выбора фрагмента, подвергаю- щегося клонированию. Расположение сайтов рестрикции в изучаемом гене можно определить без клонирования гена, используя молекулярные зонды (меченные радиоактивно или флуоресцентным красителем), комплементарные изуча- емой последовательности. Анализ состоит из последовательности следующих этапов: (1) выделение высокомолекулярной геномной ДНК из клетки; (2) ферментативное расщепление ДНК разными ре- стриктазами с образованием фрагментов разного размера; (3) разделение рестрикционных фрагментов в агарозном геле; (4) денатурация фрагментов ДНК щелочным раствором; (5) нейтрализация геля буферным раствором; (6) капиллярный перенос фрагментов на нейлоновый или нитроцеллюлезный фильтр (7) гибридизация с одноцепочечными радиоактивными зондами; (8) авторадиография для выявления гибридов: исследу- емая ДНК / зонд

В результате анализа полученного материала можно определить наличие или отсутствие некоторых сайтов ре- стрикции, характерных для изучаемого гена, которые ассо- циируются с определенными мутациями. Различные вари- анты расположения сайтов рестрикции в ДНК у двух раз- ных людей называют Полиморфизмом Длины Рестрик- ционных Фрагментов (ПДРФ). Этот полиморфизм ис- пользуется как генетический маркер в изучении генотипа.

Метод Норзерн-блот Метод состоит в переносе разделенных молекул РНК на нейлоновые или нитроцеллюлезные фильтры с последу- Рис. 12.3. Принципы переноса нуклеиновых кислот на фильтры и гибридиза- ция с радиоактивными зондами (Саузерн-блот – для ДНК и Норзерн-блот – для РНК) 202 ющей гибридизацией с мечеными зондами. Метод схож с методом Саузерн-блот, за исключением того, что выделен- ные и очищенные мРНК не подвергают рестрикции, а элек- трофорез происходит в денатурирующих условиях. Метод Норзерн-блот позволяет определить тран- скрипты анализируемых генов, кДНК, размеры генов.

3.ПОНЯТИЕ О СТРУКТУРНОЙ, ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ И ЭВОЛЮЦИОННОЙ ГЕНОМИКЕ. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОМАГено́мика — раздел молекулярной генетики, посвящённый изучению генома и генов живых организмов.

Структурная геномика — содержание и организация геномной информации. Имеет целью изучение генов с известной структурой для понимания их функции, а также определение пространственного строения максимального числа «ключевых» белковых молекул и его влияния на взаимодействия.

 Функциональная геномика — реализация информации, записанной в геноме, от гена — к признаку.

Сравнительная геномика (эволюционная) — сравнительные исследования содержания и организации геномов разных организмов.

Получение полных последовательностей геномов позволило пролить свет на степень различий  между геномами разных живых организмов. Ниже в таблице представлены предварительные данные о сходстве геномов разных организмов с геномом человека. Сходство дано в процентах (отражает долю пар оснований, идентичныху двух сравниваемых видов).

Молекулярно-генетические методы обеспечивают возможность насыщения генома маркерами и его картирования (с построением физических карт любого уровня разрешения) без использования трудоемких традиционных методов генетического картирования. В данном исследовании была построена физическая карта длиной 2000т.п.н. в области 13q14.3 хромосомы 13 человека на основе нуклеотидных последовательностей ДНК человека, клонированных в искусственных хромосомах дрожжей (УАС-клоны).
 Впервые проведены молекулярно-генетические исследования генома у представителей подсемейства Bovinae (зебу, як, буйвол и зубр), использующихся в хозяйственной деятельности человека, по генам казеинов и генам главного комплекса гисто-совместимости (DRB и DQB). Получены сведения об их генетическом разнообразии, проведен анализ межвидового и внутривидового полиморфизма генов, что имеет особую значимость для научного планирования генетико-селекционной работы и для сохранения генофонда редких видов. Ранее исследование вышеназванных видов животных проводилось, в основном, на уровне белкового полиморфизма.

Билет 25

Хромосомное определение пола

Большинство животных являются раздельнополыми организмами. Пол можно рассматривать как совокупность признаков и структур, обеспечивающих способ воспроизводства потомства и передачу наследственной информации. Пол чаще всего определяется в момент оплодотворения, то есть в определении пола главную роль играет кариотип зиготы. Кариотип каждого организма содержит хромосомы, одинаковые у обоих полов, — аутосомы, и хромосомы, по которым женский и мужской пол отличаются друг от друга, — половые хромосомы. У человека «женскими» половыми хромосомами являются две Х-хромосомы. При образовании гамет каждая яйцеклетка получает одну из Х-хромосом. Пол, у которого образуются гаметы одного типа, несущие Х-хромосому, называется гомогаметным. У человека женский пол является гомогаметным. «Мужские» половые хромосомы у человека — Х-хромосома и Y-хромосома. При образовании гамет половина сперматозоидов получает Х-хромосому, другая половина — Y-хромосому. Пол, у которого образуются гаметы разного типа, называется гетерогаметным. У человека мужской пол — гетерогаметный. Если образуется зигота, несущая две Х-хромосомы, то из нее будет формироваться женский организм, если Х-хромосому и Y-хромосому — мужской.

Синдром Клайнфельтера характеризуется недораз­витием гонад, повышением выделения гонадотропина и другими изменениями. Классической формой кариотипа синдрома Клайнфельтера является 2л (аутосом) + XXY.

Синдром Тернера характеризуется женским фенотипом с дисгенезией гонад и другими генитальными дефектами. Цитогенетически синдром Тернера определяется формулой 2л (ауто­сом) + ХО (отсутствует вторая Х-хромосома).

Гинандроморфизм (др.-греч. γυνή — женщина + ἀνήρ, род. п. ἀνδρός — мужчина + μορφή — вид, форма) — аномалия развития организма, выражающаяся в том, что в одном организме крупные участки тела имеют генотип и признаки разных полов. Является результатом наличия в мужских и женских клетках организма наборов половых хромосом с разным количеством последних, как например у многих насекомых. Гинандроморфизм происходит как результат неправильного распределения половых хромосом по клеткам в ходе нарушенного созревания яйцеклетки, её оплодотворения или дробления.

Гермафродитизм (по имени греческого бога Гермафродита (др.-греч. Ἑρμαφρόδιτος)) — одновременное или последовательное наличие у организма мужских и женских половых признаков и репродуктивных органов.

Различают естественный гермафродитизм, присущий различным видам животных и растений (однодомность) и аномальный (патологический) гермафродитизм нормально раздельнополых животных

Интерсекс (от лат. inter — между и sexus — пол) — это организм, а также эмбрион организма раздельнополого биологического вида, у которого в той или иной степени развиты признаки обоих полов. Состояние, при котором развиваются признаки обоих полов в советской научной литературе принято было называть интерсексуальностью, а сам организм и эмбриональное развитие такого организма — интерсексом.

2) Геном эукариот

Для клеток эукариот характерно наличие оформленного ядра. Информационной макромолекулой их генома является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. Однако генетическую информацию в клетках содержат не только хромосомы ядра. Жизненно важная генетическая информация заключена и во внехромосомных молекулах ДНК. Уэукариот — это ДНК хлоропластов, митохондрий и других пластид. Под геномом эукариотического организма в настоящее время понимают суммарную ДНК гаплоидного набора хромосом и каждого из внехромосомных генетических элементов, содержащуюся в отдельной клетке зародышевой линии многоклеточного организма.

Геном эукариот существенно отличается от генома прокариот по ряду признаков, среди которых необходимо отметить его избыточность. Эукариотическая клетка содержит во много раз больше генов, чем прокариотическая. Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот нельзя объяснить лишь увеличением потребности этих организмов в дополнительной генетической информации в связи с усложнением организации, поскольку большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующими последовательностями нуклеотидов. Феномен значительной избыточности генома эукариот в отношении некодирующих последовательностей нуклеотидов известен под названием «парадокса С».

Эукариотический ген можно рассматривать как совокупность сегментов ДНК, которые вместе составляют экспрессируемую единицу, ответственную за образование специфического функционального продукта — либо молекулы РНК, либо полипептида.

Семейство генов (gene family): набор генов с близкими последовательностями , возникший в результате дупликации предкового гена и последующих изменений в каждом гене семейства в процессе эволюции. Во многих случаях, гены семейства кодируют синтез сходных продуктов (например, белков ). Однако в семейства входят также и псевдогены.

Псевдогены (англ. pseudogenes) — нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в клетке. Термин «псевдоген» был впервые предложен в 1977 году. Некоторые псевдогены могут копироваться из мРНК и включаться в хромосомы, такие последовательности называются процессированными псевдогенами (ретропсевдогенами). Тем не менее, они также нефункциональны. Псевдогены происходят от обычных функциональных генов, однако утрачивают способность экспрессии в результате мутаций (появление стоп-кодонов, сдвиг рамки считывания и т. п.)

3) Основные факторы генетической эволюции в популяциях - С. С. Четвериков, Р. Фишер, С. Райт, Н. II. Дубинин, Д. Д. Ромашов и др. заложили основы современных идей о факторах, определяющих генетическую эволюцию популяций. Использование формул Харди - Вайнберга позволяет рассчитать генетический состав в популяции в данный момент и определить тенденции его изменений в ряду поколений. В целом популяции видов испытывают постоянную эволюцию их генетической структуры. Основными факторами такой эволюции являются:

1) мутации; 2) отбор (естественный и искусственный); 3) генетико-автоматические процессы, или, по-другому, дрейф генов - процессы чисто случайных изменений концентраций аллелей или зависимых от других генетических процессов - сопряженный дрейф аллелей; 4) миграции - естественные процессы смешения популяций или искусственное скрещивание друг с другом разных пород, сортов и видов.

С. С. Четвериков, Р. Фишер, С. Райт, Н. II. Дубинин, Д. Д. Ромашов и др. заложили основы современных идей о факторах, определяющих генетическую эволюцию популяций. Использование формул Харди - Вайнберга позволяет рассчитать генетический состав в популяции в данный момент и определить тенденции его изменений в ряду поколений. В целом популяции видов испытывают постоянную эволюцию их генетической структуры. Основными факторами такой эволюции являются:

1) мутации;

2) отбор (естественный и искусственный);

3) генетико-автоматические процессы, или, по-другому, дрейф генов - процессы чисто случайных изменений концентраций аллелей или зависимых от других генетических процессов - сопряженный дрейф аллелей;

4) миграции - естественные процессы смешения популяций или искусственное скрещивание друг с другом разных пород, сортов и видов.

1. Мутации изменяют частоту генов в популяциях. Частота мутирования гена — 10-5 – 10-7 на поколение. Учитывая большое количество генов у человека (порядка 30 0000), до 6% его гамет несут мутантные гены. Доминантные мутации проявляются уже в первом поколении и сразу же подвергаются действию естественного отбора. Рецессивные мутации (возникают значительно чаще) сначала накапливаются в популяции и только с появлением рецессивных гомозигот начинают проявляться фенотипически и подвергаться действию естественного отбора.

2. Дрейф генов - это случайные колебания частот генов в малых популяциях. Предположим, что на необитаемый остров попало зерно гетерозиготного самоопыляемого растения. Исходная популяция будет состоять на 100% из гетерозиготных особей (Аа). В первом поколении уже будет содержаться только 50% гетерозиготных особей: Р: Аа х Аа, F1 будет: АА + 2Аа + аа. Гомозиготы (АА и аа) дадут только гомозиготных потомков, а гетерозиготы — расщепление 1:1 (поровну гомо- и гетерозигот), поэтому в F2 уже будет 25% гетерозигот.

4. Естественный отбор элиминирует из популяции менее удачные комбинации генов и избирательно сохраняет более удачные генотипы, тем самым, изменяя частоту генов в популяциях.

Интенсивность естественного отбора даже в современных человеческих популяциях довольно высокая: спонтанные аборты составляют примерно 50% всех зачатий; мертворождения — 3%; ранняя детская смертность— 2%; не вступают в брак около 20% людей; примерно 10% браков бесплодны. Таким образом, около 75% людей не вносят свой вклад в генофонд будущих поколений.

Помимо естественного отбора в популяциях (в том числе и человеческих) может действовать и контротбор — это отбор неблагоприятных в обычных условиях среды признаков.

 

Билет 26


Дата добавления: 2018-02-18; просмотров: 485; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ