Определение протеолитической активности (метод ВНИИФСа)
Протеолитическая активность характеризует способность ферментов катализировать расщепление белков до пептидов и аминокислот. Культуры плесневых грибов характеризуются числом единиц протеолитической активности (ПАк), содержащихся в 1 г исследуемого материала.
За единицу протеолитической активности принимается такое количество ферментов, которое катализирует расщепление 1 г белка в строго стандартных условиях (температура 30° С; рН среды 7,0; продолжительность протеолиза 30 мин; постоянное соотношение фермент — субстрат в среде, обеспечивающее гидролиз белка на 50% до продуктов, не осаждающихся трихлоруксусной кислотой за 30 мин).
В основу определения протеолитической активности положена зависимость степени протеолиза белка от числа единиц фермента, взятого на анализ для проведения ферментативной реакции.
Количество превращенного белка определяют с применением интерферометрического метода. Активность ферментных материалов определяют по специально выведенному графику (или уравнению), на котором по оси ординат отложена разность показателей преломления, а по оси абсцисс — число единиц фермента.
Относя полученную величину к 1 г исследуемого ферментного материала, определяют его активность в условных единицах.
Для определения протеолитической активности поверхностной культуры готовят вытяжку из нее (5 г воздушно-сухой или 10 г сырой культуры на 100 мл), при определении в глубинной культуре ее разбавляют описанным выше способом.
|
|
|
Для приготовления рабочего раствора берут различное количество основного раствора в зависимости от предполагаемой активности культуры и разбавляют дистиллированной водой до 50 или 100 мл.
B качестве субстрата используют 1%-ный раствор казеина.
Ход определения. В пробирку высотой 180 мм и диаметром 20 мм берут 10 мл субстрата и помещают ее в ультратермостат с температурой 30±0,2°С на 5—10 мин, чтобы раствор принял необходимую температуру. Затем, не вынимая пробирки из термостата, наливают в нее 5 мл рабочего ферментного раствора (испытуемая проба), смесь перемешивают и выдерживают в термостате в течение 30 мин для протеолиза белка под действием исследуемых ферментов. По истечении этого времени в пробирку наливают 10 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента и осаждения высокомолекулярных продуктов протеолиза, жидкость перемешивают и смесь выдерживают в том же ультратермостате (t = 30° С) в течение 15 мин.
Одновременно ставят контрольный опыт, для чего в пробирку наливают 10 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и приливают 5 мл ферментного раствора, который инактивируется под действием кислоты. Содержимое пробирки перемешивают, выдерживают 5 мин, приливают к смеси 10 мл субстрата и ставят в ультратермостат с температурой 30° С на 15 мин для осаждения белка. Затем пробирки вынимают из термостата, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют содержимое через бумажный складчатый фильтр. В прозрачном фильтре определяют интерференцию на интерферометре марки ИТР-2 и снимают показания т на барабане прибора. Показания барабана определяются разностью показателей преломления (А∆) двух сравниваемых жидкостей, поэтому для простоты расчета при анализе можно пользоваться этим показанием.
|
|
|
При работе с прибором используют кювету с длиной грани 2 см, наливая в правую ее камеру контрольный, а в левую— испытуемый растворы. Для обеспечения точности анализа необходимо, чтобы в процессе ферментативной реакции в продукты, не осаждаемые трихлоруксусной кислотой, перешло 20—75% белка. Для этого на анализ необходимо брать такое количество культуры, чтобы показания барабана интерферометра т не превышали 500. Значение т пропорционально разности показателей преломления, которая в данном случае определяется количеством образовавшихся при гидролизе белка продуктов, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой (аминокислот и .пептидов). Количество этих продуктов определяет скорость ферментативной реакции гидролиза белка, а следовательно, и активность исследуемого материала в принятых единицах.
|
|
|
Активность протеолитических ферментов (ПС) определяют по специально разработанному уравнению, подставляя в него полученные при анализе показания барабана интерферометра т
ПС= 
где 0,1702 и 10,213 — коэффициенты, найденные экспериментально.
Пример. На анализ взята поверхностная культура гриба Asp. oryzae.
Приготовлен основной раствор с содержанием 5 г культуры в 100 мл. На приготовление рабочего раствора взято 7,5 мл основного и объем его доведен до 50 мл дистиллированной водой. В 5 мл такого рабочего раствора содержится 0,0375 г культуры (n = 37,5 мг).
При анализе получено показание интерферометра m = 320. Протеолитическая активность культуры составит
ПС= 
= 1,18 ед./г.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 309; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!