Колориметрический метод определения осахаривающей активности ОС (метод ВНИИПрБ)

Осахаривающая активность характеризует способность ферментов катализировать гидролиз крахмала до сахаров.

Активность солода и культур плесневых грибов характеризуется числом единиц осахаривающей активности ОС, содержащихся в 1 г исследуемого материала. В основу определения осахаривающей активности положена зависимость количества крахмала, превращающегося в сахара в процессе ферментативного гидролиза, от числа единиц активности фермента, взятого на анализ.

Количество взятых на определение единиц фермента узнают по выведенному графику (или соответствующему ему уравнению), где по оси ординат отложена оптическая плотность, пропорциональная количеству образовавшегося сахара, а по оси абсцисс — число единиц фермента. Относя полученную величину к 1 г исследуемого ферментного материала, определяют его активность в условных единицах.

За единицу осахаривающей активности (ОС) принимается такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала до спирто-растворимых сахаров, определяемых в ед. глюкозы, в строго определенных стандартных условиях (температура реакции 30° С; рН раствора 4,85 и время 10 мин; постоянное соотношение фермент — субстрат в реакционной жидкости, обеспечивающее превращение крахмала за 10 мин в глюкозу на 10%).

Для определения осахаривающей активности используют ту же реакционную среду, в которой определяют амилолитическую активность. Устанавливают в ней содержание спирторастворимых сахаров (в ед. глюкозы), образовавшихся в процессе ферментативной реакции, которое определяют в фильтрате после осаждения высокомолекулярных углеводов спиртом, с применением антронового колориметрического метода.

Для определения берут 3 мл реакционной жидкости в мерную колбу на 25 мл, добавляют для осаждения непрогидролизованного крахмала и декстринов 22 мл спирта-ректификата (96% об.), осадок отфильтровывают, от фильтрата отбирают 25 мл и разбавляют его водой в 2 раза. В разбавленном фильтрате непосредственно определяют сахар. Для этого берут 5 мл антронового реактива, помещают его в пробирку из тугоплавкого стекла с притертой пробкой и осторожно по стенке пробирки доливают к реактиву 2,5 мл разбавленного спиртового фильтрата с таким расчетом, чтобы жидкости не смешивались, а образовали два слоя, после чего пробирки закрывают притертой пробкой.

Параллельно готовят холостую пробу путем добавления таким же способом к 5 мл реактивов 25 мл разбавленного спирта (3 мл воды и 22 мл спирта) с последующим разбавлением раствора водой в 2 раза. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 10 с, ставят в штатив и погружают в бурно кипящую водяную баню, замечают начало кипения воды в бане, которое должно возобновиться через 0,5 мин, и выдерживают раствор в бане 5,5 мин. Общее время выдержки проб в бане должно быть 6 мин. Затем штатив с пробирками вынимают, помещают в баню с проточной водой (температурой 8—10° С) и охлаждают жидкость до 20° С.

Раствор после реакции приобретает сине-зеленую окраску. В окрашенных растворах определяют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре по инструкции, прилагаемой к прибору, в кювете с длиной грани 0,5 см и при длине световой волны λ= 610 нм, снимая показания по красной шкале левого барабана. Если окажется, что оптическая плотность раствора больше 0,800 или меньше 0,150, то анализ повторяют, уменьшая или увеличивая количество основного раствора для приготовления рабочего. Если при анализе оптическая плотность будет находиться в указанных пределах, полученные данные используют для определения осахаривающей активности по следующему уравнению:

ОС=

Пример. Для анализа взят ячменный солод влажностью 42,0%. Приготовлена вытяжка 5 г солода на 100 мл воды с фосфатным буфером; для вторичного разбавления взято 2 мл вытяжки на 100 мл воды.

В 5 мл разбавленного раствора находилось

=0,005 г

солода (n=5). При колориметрировании получили значение оптической плотности 0,652.

Осахаривающая активность солода

ОС= =19,36 ед/г

или на абсолютно сухое вещество солода при влажности его 42%

=33,38 ед/г

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 122; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!