Методы определения протеолитической активности бактерий

⇐ ПредыдущаяСтр 32 из 97Следующая ⇒

Протеолитическая активность микробов направлена на расщепление белков до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов. Действие протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Тест на желатиназу. Культуру микроорганизмов засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение нескольких (5-7) дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер. Разжижение может быть послойным, что свойственно бактериям сине-зеленого гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя; стафилококки – в виде чулка. Рост сибиреязвенных бацилл напоминает елочку, перевернутую вершиной вниз (характер разжижения послойный).

Тест на растворение свертка казеина. Культуру засевают на обезжиренное молоко. Культура расщепляет молочный сахар (лактозу) и за счет закисления среды наблюдается свертывание молочного белка (казеина). При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется – пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок.

Тест на свернутой сыворотке крови. Культуру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола. Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой, предварительно произведя посев исследуемой культуры. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы при расщеплении сложной гетероциклической кислоты - триптофана.

Определение сероводорода. Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца.

Тест на аммиак.Аммиак определяют при помощи увлажненной розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Посевы инкубируют в термостате 1-5 суток. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

Изучение сахаролитических и протеолитических ферментов часто оказывается достаточным для определения вида, но в некоторых случаях возникает необходимость включать в изучение другие ферменты: уреазу, каталазу, цитохромоксидазу, нитратредуктазу и др.

Тест на уреазу. Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды-желтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный.

Тест на нитратредуктазную активность. Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Выявление нитратредуктазы (фермента восстанавливающий нитраты в нитриты) характерно в основном для факультативных анаэробов. Способность к восстановлению NO₃ в N0₂, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO₃. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса, содержащий уксусную кислоту. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Тест на каталазу. Каталаза — это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов, на которых перекись водорода оказывает губительное действие. Бактериологическую петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды суспезируют в капле 3% раствора перекиси водорода на предметном стекле. Образование пузырьков газа свидетельствует о проявлении каталазной активности.

Тест на оксидазу (цитохромоксидазу). Цитохромоксидаза — это фермент, обеспечивающий перенос электронов на кислород в процессе аэробного дыхания. Активность цитохромоксидазы учитывают при дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae и др. Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2—5 мин.

Тест на плазмокоагулазную активность. Плазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Петлю агаровой культуры стафилококка суспензируют в 0,5 мл цитратной кроличьей плазме, разведенной 1:5. Результаты регистрируют через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации проб в термостате при температуре 37°С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка свидетельствует о наличии плазмокоагулазы.

Тест на гемолитическую активность. Определяется при посеве испытуемых микроорганизмов на кровяной агар. Гемолитическая активность характеризуется появлением зоны просветления среды вокруг колоний.Различают β-гемолиз (полный гемолиз), когда образуются зоны просветления вокруг колоний, α-гемолиз или неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как γ-гемолиз.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения. Определение образования ацетона проводится при добавлении к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола. При наличии ацетоина жидкость приобретает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.

Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 2733; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 27 28 29 30 313233 34 35 36 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!