Окрашивание препаратов культуры фибробластов человека иммунофлуоресцентным методом
Выявление маркерных молекул осуществлялось иммунофлуоресцентным методом с использованием первичных антител.
Таблица 1. Используемые антитела
| № | Название | Фирма | Разведение |
| 1. | Mouse monoclonal TRF1 antibody | Abcam | 1:100 |
| 2. | Rabbit polyclonal Calreticulin antibody | Abcam | 1:200 |
В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam) антитела. Протокол выполнения данной экспериментальной работы был предоставлен компанией ABCAM [41].
1. Промывка* клеточной культуры раствором PBS.
2. Фиксация клеток: для фиксации используется 4% параформальдегид на PBS (инкубация в течение 15 минут при комнатной температуре).
3. Промывка раствором PBS (три смены по 3 минуты).
4. Отмывка дистиллированной водой (3 минуты).
5. Необходимо пермеабилизировать клетку, если исследуемый белок – внутриклеточный. Пермеабилизация клеток осуществляется 0,25-0,5% раствором Triton X-100 на PBS (Биолот, РФ) в течение 15 минут при комнатной температуре.
6. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
7. Инкубация в 1% бычьем сывороточном альбумине, разведенным PBS, pH 7,5 в течение 15 минут для блокировки неспецифического связывания.
8. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
9. Инкубация с первичными антителами (см. Табл.1) (время и условия инкубации установлены производителем в инструкции к а/т).
10. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
11. Инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor (в разведении 1:1000) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
|
|
|
12. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
13. Ядра клеток докрасить Hoechst 33258 (разведение 1:100 от стокового раствора в dH2O; Sigma, США) в течение 1 минуты.
14. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
15. Готовые препараты заключить под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Хранить в темноте, во избежание быстрого выгорания флуорохрома.
* Промывка необходима для того, чтобы субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов, удаляются при многократной промывке.
3.4 Морфометрический анализ
Для анализа полученных результатов использовали конфокальный микроскоп Olympus FluoView 1000 (Япония) и программное обеспечение «Vidеotest Morphology 5.2».
Площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер.
Рисунок 11. Olympus FluoView 1000
Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной токи объекта.
|
|
|
Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки 11 оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.
Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Следует сделать вывод, что изучение биологической активности линии инъекционных препаратов с использованием синтетических пептидов показало несомненно высокую физиологическую активность пептидных регуляторов и перспективность их дальнейшего использования. Пептиды обладают способностью регулировать экспрессию генов, которая является их ключевым свойством. Фактически они представляют собой биотехнологическую копию активного фрагмента более крупных регуляторных пептидов. Следовательно, биомиметические пептиды легче достигают рецепторов клеток-мишеней, фокус их действия более направленный, и они имеют меньший аллергический потенциал.
|
|
|
Еще одной особенностью биомиметических пептидов является то, что они действуют не только по принципу «заместительной терапии», восполняя дефицит в тканях различных факторов роста и контактируя с клеточными рецепторами. Они также модулируют активность генетического аппарата клетки и регуляторные процессы таким образом, что переводят клетку на наиболее рациональный режим функционирования.
На молекулярном уровне целевое воздействие биомиметических пептидов заключается в усилении экспрессии генов и активизации синтеза следующих основных сигнальных молекул: противовоспалительных интерлейкинов, эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов, инсулиноподобного фактора роста, внутриклеточных молекул адгезии, тромбоцитарного фактора роста, антиапоптозных факторов и др. С возрастом образование этих молекул снижается, что является одной из причин появления признаков старения кожи: изменения ее структуры, нарушения кровоснабжения клеток, усиления пигментации, снижения степени иммунной активности, замедления роста придатков кожи, включая волосы. Воздействие биомиметических пептидов приводит к положительному влиянию на такие важные патогенетические механизмы старения, как апоптоз (самопроизвольная гибель клеток), пролиферация (клеточное обновление) и хроническое иммунное воспаление.
|
|
|
Важно подчеркнуть, что каждый конкретный биомиметический пептид обладает совершенно определенным действием, которое определяется его химическим строением. То, какой вид сигнальных молекул будет вырабатываться в тканях при воздействии пептида, определяется последовательностью аминокислот в его цепочке и спецификой воздействия на клеточное ядро.
Результаты данного исследования убедительно демонстрируют эффективность пептидного комплекса Aquashine и подтверждают ее объективными морфологическими исследованиями. Исследованные параметры имеют неразрывную связь с клиническими проявлениями старения кожи и борьбы с ними.
Под действием пептидного комплекса Aquashine значительно повышается синтетическая активность фибробластов, что подтверждается повышением экспрессии TERF1 и кальретикулина. Под воздействием новой линии препаратов Aquashine в культуре клеток фибробластов наблюдалось активация экспрессии TERF-1, что способствует стабильности теломер хромосом и, таким образом, защищает клетки от преждевременного старения.
При введении новой линии препаратов Aquashine in vitro было показано увелечение площади экспрессии кальретикулина в фибробластах, что свидетельствует об усилении внутриклеточного синтеза белков. Это способствует жизнеспособности кожи и препятствует ее преждевременному старению.
Проведённые исследования убедительно продемонстрировали высокую активность препарата. Это позволяет с позиций доказательной медицины экстраполировать полученные результаты на клиническое использование и прогнозировать выраженный эффект лифтинга, уплотнения кожи и её омоложения при использовании Aquashine в программах anti-age коррекции.
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 181; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!