Результаты работы и их обсуждение. Влияние линии препаратов Aquashine на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека.
Имунофлуоресцентный метод и его преимущества
Эксперимент был проведён методом непрямого имунофлуоресцентного анализа, который основан на визуальном учёте антител с гомологичным антигеном. Это один из самых простых и быстрых методов иммуногистохимии. Методы иммунофлуоресценции (IF) или визуализации клеток основаны на использовании антител для маркировки специфического целевого антигена флуоресцентным красителем (также называемым
флуорофоры или флуорохромы). Наиболее часто используемыми флуорохромами являются флуоресцеин или FITC, родамин, фикоэритрин (РЕ), Dylight, Texas Red. В данной работе было отдано предпочетение Alexa Fluor, которые использовались в данной работе.
Семейство Alexa охватывает широкий спектр длин волн возбуждения и излучения от видимого до инфракрасного света и классифицируется в соответствии с их максимумами возбуждения (таблица 1).
Таблица 1: Информация об особенностях красителей Alexa от Thermo Fisher Scientific.
| название | Поглощение (λ / нм) | Эмиссия (λ / нм) | цвет |
| Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | синий |
| Alexa Fluor 405 | 401 | 421 | синий |
| Alexa Fluor 430 | 433 | 541 | Желто-зеленый |
| Алекса Флуор 488 | 496 | 519 | зеленый |
| Alexa Fluor 532 | 532 | 553 | желтый |
| Alexa Fluor 546 | 556 | 573 | оранжевый |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 565 | оранжевый |
| Alexa Fluor 568 | 578 | 603 | Оранжево-красный |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | красный |
| Alexa Fluor 610 | 612 | 628 | красный |
| Alexa Fluor 633 | 632 | 647 | Далеко-красный |
| Alexa Fluor 635 | 633 | 647 | Далеко-красный |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 665 | Ближний ИК |
| Alexa Fluor 660 | 663 | 690 | Ближний ИК |
| Alexa Fluor 680 | +679 | 702 | Ближний ИК |
| Alexa Fluor 700 | 702 | +723 | Ближний ИК |
| Alexa Fluor 750 | +749 | 775 | Ближний ИК |
| Alexa Fluor 790 | +784 | 814 | Ближний ИК |
|
|
|
Хотя их химическая структура красителей не опубликована, Alexa Fluor обычно синтезируются путем сульфирования таких красителей, как флуоресцеин, цианин, кумарин и родамин. Это сульфирование делает красители Alexa отрицательно заряженными и гидрофильными.
Эмиссия от красителей Alexa может быть обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии. Как вы можете видеть на рисунке, этот диапазон красителей обеспечивает впечатляющий диапазон длин волн излучения.
Рисунок Данные спектров эмиссии красителей Alexa, [Thermo Fisher Scientific]
Красители Alexa представляют собой серьезную разработку в области применения флуоресценции, поскольку они обладают многими преимуществами. Alexa Fluor демонстрируют большую яркость, относительно других спектрально подобных конъюгатов. Поэтому они требуют меньшего общего количества образцов в экспериментах, позволяя обнаруживать мишени с низким содержанием. Конъюгаты Alexa Fluor обладают большей фотостабильностью, чем другие, что дает больше времени для захвата изображений.
|
|
|
Возвращаясь к методке, существует два способа проведенияIF в зависимости от того, конъюгирован ли флуорофор с первичным или вторичным антителом:
· Прямой метод использует одно антитело, направленное против интересующей мишени. Первичное антитело непосредственно конъюгировано с флуорофором;
· Непрямой (косвенный) использует два антитела. Первичное антитело является неконъюгированным и флуорофоры-конъюгированного вторичного антитела, направлены против первичного антитела, таким образом происходит обнаружение мишени.
В данной работе было отдано предпочтение непрямому методу несмотря на то, что меньшее количество шагов в протоколе упрощает выполнение анализа. Сигнал, полученный прямым методом, может показаться слабым по сравнению с косвенным, поскольку усиление сигнала, обеспечиваемое использованием вторичных антител, не происходит.
Выбор нМФА основан на высокой чувствительности и точности. Под высокой чувствительностью понимается возможность распознавания искомое даже при его небольшом содержании в образце.
Одним из преимуществ перед прямым методом является отсутствие необходимости иметь большой набор специфических флуоресцирующих антител, так как сама методика основана на использовании антиглобулиновых (антивидовых) антител, меченных флуорохромом.
|
|
|
Относительно других методик, данный нМФА имеет следующие преимущества: простота, небольшой расход реагентов, экономическая целесообразность, выраженная в доступности необходимых препаратов. Однако, необходимо учитывать такие недостатки, как необходимость специального оборудования. В анализе используется дорогостоящий флуоресцентный микроскоп, оборудованный соответствующим программным обеспечением.
Связывание молекул обнаруживают путем инкубации образца со вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором. Это обеспечивает видимый сигнал, который наблюдается с помощью флуоресцентного микроскопа.
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 148; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!