Металл иондары кофактор рет i нде 4 страница
Протопластарды бөлу кезеңінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады.Протопластар бүтін болуы үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болуы керек.Кейде материалды алдын –ала плазмолиздік ерітіндісінде біраз ұстайды.Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза,сахароза,сорбит,маннит) пайдаланылады.Осмостық қысымның дәл концентрациясы өсімдіктің нақты түрінен және оның физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады.Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады.Ферменттік ерітіндінің РН көрсеткішіндегі бір деңгейде (5,4-6,2 ) ұстау үшін буфер қосады.
Протопластарды бөлу кезеңінде аэрацияның маңызы зор.Слндықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітіндінің түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады.Протопластарды ала көлеңкеде немесе қараңғыда бөліп алады.Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне,РН және температураға байланыста,1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады.Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өңдеу уақытын жеке іріктеп алу қажет.Температура әр деңгейде болады,мысалы бидайда 14 градус С болса,томатқа ең қолайлысы 27 градус С.
|
|
|
Протопластар бөлініп алынған соң,олар ұлпаның қалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек.Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады.Инкубациялық қоспаның тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді,одан кейін протоплас суспензиясын центрифугалайды.Центрифугалау тәртібі осмостық затқа байланысты.Егер ферменттік ерітіндісі 0,4-0,5 м сахарозада дайындалса,100-200гр 2-3 минут бойы центрифугалайды.Протопластар үстіне қалқып шығады,оларды Пастер пипеткасымен сорып алып,2 рет тұздың ерітіндісімен шаяды.Тығыздығы төмен басқа осмостық заттарды (маннит,сорбит)қолданған кезде ,протопластар центрифугалау кезінде тұнба болып шөгеді.Оларды 2 рет жуады.Одан кейін протопластарды тұздың ерітіндісінде немесе 0.4м маннит,сорбит,глюкоза ерітіндісіне нгемесе өсіретін қоректік ортаға салып,суспензиясын алады.
Тіршілікке қабілетті протопластарды алу
Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты.Олар атап айтқанда:ұлпаның шығу тегі (жапырақ,тұқым жапырақ,тамыр,тозаң түйірі,каллус ұлпасы,суспензиядағы клеткалар),өсімдіктің түрі мен сорты,өсімдіктің физиологиялық күйі,ферменттердің құрамы,олардфың сапасы,ортаның Рн және осмостық заттың түрі.
|
|
|
Протопластарды In vitro өсіру
Протопластарды In vitro түрлі тәсілдермен өсіруге болады.Өсіру тәсілі тәжірибенің мақсатына байланысты.Алдымен протопластардың қоректік ортада шайқап жуып ферменттерден тазартады.Содан соң олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады.Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардың тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді.Ол үшін протопластарды әртүрлі көлемі бар ортаға салады.
Ал,керісінше,протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды қоректік орта мол құйылған ыдысқа көшіреді.Сөйтіп,протопластардың 1 мл ортадағы санын оқтын-оқтын есептеу арқылы олардың тығыздығын жасайтын тәжірибеге сайма-сай келтіреді.
Протопластарды сұйық ортада өсіргенде клеткаларды өсірген сияқты олардың тығыздығы жоғары болуы керек.Көбінесе бұл көрсеткіш 1-мл 104---105клетка болады.Егер қоректік орта сұйықталып,протопластар саны бұдан аз болса,лнда олар жөнді өсе алмайды.Өте сұйық суспензияда протопластардың ішіндегі тіршілікке қажетті кейбір метоболиттер плазмолемма арқылы ортаға шығып кететін көрінеді.Сондықтан протопластардың тіршілік қабылеті едәуір кемиді.Осының дәлелі ретінде мынадай мысал келтіруге болады.Әдетте ісік ұлпалардан алынған клеткаларды суспензияда өсіргенде қоректік ортаға ауксин мен цитокинин гормондарын қоспайды.Өйткені бұл гормондар осындай ісік клеткаларының өздерінде түзіледі.Сұйық ортада өсіргенде клетка қабығы ол гормондардың клеьканың ішінен сыртына шығуын бөгейді де ,ондай эндогендік метоболиттерді клетканың өзіде пайдалана алады.Ал ісік клеткалардан бөліп алынған протопластарды суспензияда өсіру үшін қоректік ортаға міндетті түрде экзогендік ауксин мен цитокининді қосу керек.Себебі,жоғарыда айтылғанын-дай,олардың өз эндогендік гормондары клетканың қабығы болмағандықтан плазмолеммадан шығып кетеді.
|
|
|
Протопластардың өсуіне жақсы жағдай жасау үшін «Қоректік қабат» әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны қолданады,болмаса олар өсіп жатқан ортаның көлемін минимумға дейін азайтады. «Астыңғы қоректік қабат» ретінде рентген немесе гамма сәулелері әсер ететін протопластар мен клеткалар пайдаланылады.Сол әсерден ондай клеткалар бөліну қабылетінен айыры-лады,бірақ басқа клеткалардың өсуіне жағдай туғызады.Осы әдістің тағы бір түрі,ол нашар өсетін протопластарды жақсы өсетін протопластармен бірге өсіру.Байытылған орталар өсімдіктердің шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.
|
|
|
Протопластарды өсірудің кең таралған әдісі,оларды жоғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкм тамшыларда өсіру.Петри табақшасының қақпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтық пипеткамен салы-нады.Протопластарды өсіру үшін бұл әдістің тиімділігі-материалдар мен уақытты үнемдеп,қоректік ортаның мыңдағын вариантарын тексеруге мүмкіншілік береді.Бірақ бұл әдістің де кемшілігі бар,ол протопластардың тамшының ортасына жыиылуы.
1978жылы украйн ғалымы Ю.Ю.Глеба жеке протопластарды қоректік ортаның көлемі 1мкл дейін микротамшыларда өсіру әдісін жете зерттеп дайындады және өзінің зерттеу жұмысында осы әдісті нәтижелі қолданды.Осындай көлемдегі микротамшыда бір клетка болса,онда клетка көлемінің ара-қатнасы әдеттегі өсіргендей тығыздығы 1милилитрде 104 клеткасы бар суспензиямен бірдей болады.Протопластарды алдын-ала 1-3 күн тығыздығы жоғары (104-105 клетка )суспензияда өсірілсе,кейін сондай суспензиядан алынған жеке протопластарды микротамшыда өсірудің тиімділігі арта түседі.
Протопластарды суспензия ретінде сұйық орта ғана емес ,біраз қоюланған ортада да өсіруге болады.Ол үшін ыдысқа құйылған қоюланған ортаның бетіне жұқа қабат етіп қана протопластарды салады.Бұл әдіс бойынша,сұйық ортамен көлемі тең қоюланған ортада протопластардың концентрациясын екі есе көбейтіп өсіруге болады.
Протопластарды агары бар қатты ортада да өсіруге болады .Ол үшін протопластар сцуспензиясын 1,2 процент агары бар жылы (45 градус С ) көлемі бірдей ортамен араластырады.Орта суып қатқан соң оның ішіндегі протопластар бір-бірінен алыстау болып бекітіліп орналасып қалады.Осы агарда орнықтыру әдісі протопластардың әр-қайсысының өсуін жеке бақылап отыруға мүмкіндік береді.Агар орнына агароза қолданылса клеткалардың бөлінуін арттыруғаболады.Агароза агардың құрамына кіреді,шамасы агар екі полисахаридтің- агароза мен агаропектин –қоспасы.Бұл тәсіл,әсіресе өсу қарқыны бәсең немесе өспей қалған протопластарға қолайлы.
Клетка қабығы қайта пайда болып,клетканың алғашқы бөлінуі үшін қоректік заттар орташа мөлшерде қажет болады.Ортаның концентрациясы жоғары болса,протопластардың күй жағдайы тіпті нашарлауы мүмкін.Ал екі-үш рет бөлінгеннен соң клеткалар қоректік заттардың жетіспеушілігінің зардабыншеге бастайды.Егер осы кезде орта байытылмаса,бөлінуі тежеліп,клеткалар тіпті құрып кетуі де мүмкін.Өсіру кезінде қоректік ортаны байытудың екі жолы бар;
Жоғары концентрациялы қоюылтылған ортаны тамшылап қосып отыру және қоректік қабатты қолдану.
Бірінші жолдың кемшілігі,концентрациясы жоғары ортаны қосқан сайын инфекциялану қаупі туады. Ал екінші жолғы тәуірірек,себебі құрамы бай қоректік орта ыдысқа алдын-ала құйылады.Ол қатқан соң үстіне протопластар салынады.Сөйтіп алғашқы күндері протопластар қоректік заттар азырақ ортада өседі,кейінірек қарқынды бөлініп келе жатқан клеткаларға астыңғы қатты қабаттан диффузия арқылы қажетті заттар келіп жатады.
Протопластарды клеткалар мен ұлпаларды өсіретін белгілі қоректік ортада өсіреді.Протопластарды өсіретін қореуктінк ортаның негізгі айырмакшылығы-Са концентрациясы 2-4 есе артық және 0,4-0,8 м осмостық заттардың қосылуы.Протопластарды өсіру үшін кеңінен қолданылатын қоректік орталар;өзгертілген Мурасиге – Скуг ортасы (көбінесе ол нагата немесе такеба ортасы деп аталады );Гамборгтың В ортасы және Као мен Михайлугтың ортасы (бұл витаминдер мен амин қышқылдармен және қанттармен,кейде фитогормондардың күрделі құрамы мен байытылған.Гамборгтың В ортасы).Мұнда қанттар (ксилоза,рибоза,целлобиоза,манноза,рамноза) осмотик ретінде ғана емес,клетка қабығының тез пайда болуына әсер етеді.
Өсімдіктердің әр түрлерінен бөлініп алынған протопластардың өсуіне қолайлы көптеген қоректік орталар жеке зерттеліп ұсынылды.Қоректік орталарды іріктеп алу көбінесе тәжірибеге негізделген.Оның ең лайықты құрамы өсімдіктің түрі тұрмақ,тіпті жеке сорт үшінде таңдалады.Нақтылы әр бір өсімдіктен алынған протопластардың қоректік ортаға реакциясын зерттеу үшін оларды «аспа тамшылар» әдісімен өсіріп ,бірнеше факторларға белгілі схема бойынша әртүрлі комбинацияда құралған қоректік орталарында өсіреді.
48. Өсімдіктердің клеткалық сұрыптау әдістері.
Сұрыптау әдісінің түрлері
Сұрыптау өсімдіктер селекциясының негізгі әдістерінің бірі болып табылады. Сұрыптау әдістері өсімдіктің белгілі бір түрінің көбею формасына байланысты. Сұрыптау – жаппай және жеке болып екі негізгі формаға бөлінеді.
Жаппай сұрыптау
Жаппай сұрыптау дегеніміз бастапқы материалдан селекционер үшін тиімді белгілері бар особьтар топтарын бөліп алу. Жаппай сұрыптау айқас тозаңданатын өсімдіктерге жиі қолданылады. Қарабидайдың көп тараған (мысалы Вятка сорты) сорттары осы жолмен шығарылған. Жаппай сұрыптау арқылы біртекті генотиптік материал бөліп алуға болмайды, өйткені айқас тозаңданатын өсімдіктер популяцияларында әрқашан да көптеген гетерозиготалық особьтар болады. Жалпы сұрыптау әдетте келесі бірқатар ұрпақта әлденеше рет, кейде бір рет қолданылады.
Жеке сұрыптау
Жеке сұрыптау адамдардың назарын аударатын белгілері бар және олардан ұрпақ алуға болатын жекелеген особьтарды бөліп алуға негізделеді. Ол да бір реттік немесе қайталанбалы бола алады. Бұл әдіс өздігінен тозаңданатын (бидай, арпа, сұлы) өсімдіктерге қолдануға қолайлы. Өздігінен тозаңданатын бір особьтың ұрпағын таза линия деп атайды. Жеке сұрыптау өздігінен тозаңдану арқасында гомозиготалық формалардан тұратын таза линия бөліп алуға әкеп соғады. (Гетерозиготалар санының кеміп, гомозиготалар санының артуына әкеп соғатфн моногибридтік шағылыстыруды естеріңе түсіріңдер). Жеке сұрыптаудың нәтижесінде бір немесе бірнеше гомозиготалық таза линия болып табылатын сорттар алынады. Алайда таза линия ішінде де мутация болып гетерозиготалы особьтар кездеседі. Вегетативтік жолмен көбейетін өсімдіктер сорттарында шаруашылыққа пайдалы блгілері бар кез-келген гетерозиготалы форманы сақтап, көбейтуге болады. Жынысты жолмен көбейгенде гетерозиготалы особьтардан тұратын сорттардың қасиеттері сақталмайды және олар ажырай бастайды.
49. Өсімдіктердің өнімділігін және сыртқы қолайсыз ортаға төзімділігін арттыруда гендік инженерия әдістерін қолдану маңызы
«Гендік инженерия». Өсімдік биотехнология-сындағы гендік инженерияның принциптері. Гендерді өсімдіктерге тасымалдау әдістері (жалпы сипаттамасы); микроинъекция әдісі, электропорация, баллистік әдіс. Молекулалық клондауға арналған векторлар – плазмидалар (әсіресе агробактериялардың плазмидалар), фагтік векторлар, вирустар. Өсімдік биотехнологиясында қолданылатын векторлық жүйелер: хлоропластық және митохондриялық ДНҚ. Трансгенді өсімдіктерді алу үшін геномның мобильді (жылжымалы) элементтері негізіндегі векторларларды қолдану. Жасанды хромосомалар көмегімен гендерді тасымалдау. Трансгендік өсімдіктерді пайдалану және олардың теориялық маңызы. Өсімдік ДНҚ геномының библиотекасын құрастыру. Гендік инженерияның мүмкіндіктері және оның болашағы.
In vitro жағдайында жаңа формаларды шығаратын әдіске гендік инженерия жатады. Тікелей ДНҚ-ның деңгейінде өткізетін жасанды өзгерістер арқылы нәсілдік қасиеті өзгерген өсімдіктерді, тіпті мүлде жаңа формаларды шығаруға болады, бұндай тәжірибелерді гендік инженериясы атқарады.
Іn vitro жағдайында пайда болатын генетикалық өзгерістер арқылы түзілген сомаклондық өсімдіктерді алу немесе трансгенді өсімдіктерді алу, яғни қажетті қасиеттерді белгілейтін бөтен генді мәдени өсімдіктің гендік аппаратына еңгізіп жаңа өзгерілген түрін алу (мысалы трансгендік технологиямен колорадтік қоңызға төзімді картоптың түрін алды, яғни Bacillus turinga деген топырақтадағы бактериядан қоңызға үлы белокты белгілейтін генді E.coli арқылы картоптың ДНҚ-ға еңгізді, алынған трансгендік картоптың жапырақтарында қоңызға үлы, бірақ адамға әсері етпейтін белок жиналады, сондықтан колорадтік қоңыз картопты жимейді да зиянды тигізбейді).
Құрылымдық гендерде тек қана метаболизм өтудің нәтижесінде түзілетін заттардың (белоктың, мРНҚ-ның) коды жазылған. Оларда ген белсенділігін реттейтін бөлшек мүлдем жоқ. Сондықтан, жаңа құрылымдық гендерді иеленген клеткаларда ол гендер өз бетімен тиісті қызметін атқара алмайды. Гендердің клеткадағы әрекетін басқаратын репликация және транскрипция сигналдарын оларға вектор қамтамасыз етеді.Бөтен генді клетка ішіне тасымалдап алып баратын арнаулы ДНК молекуласын вектор дейді. Оған мынадай талаптар қойылады:
1)өз алдына репликациялану, яғни клетка ішіне бөтен генді алып кірген соң клеткамен бірге немесе өз алдына көбейе алатын болуы керек; немесе вектор клетка хромосомасының құрамына еніп, онымен бірге ұрпақ клеткаларға беріліп отыруы керек;
2) трансформацияланған клеткаларды анықтау үшін оның ерекше генетикалық белгілері (маркерлері) болуы керек (мысалы, антибиотикке төзімділігі);
3) құрамында рестриктазалар үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек және репликацияға қабілетін жоғалтпауы керек;
4) векторға орналастырылған бөтен ген оның атқаратын қызметін бұзбауы керек, ал вектор болса, ол да енгізілген геннің ішінде дұрыс реттеліп жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болуы керек;
5) вектордың көлемі кішігірім болуы керек.
Әдетте, құрылымдық ген өте қысқа болып келеді (бірнеше жүз нуклеотид). Оны бірден көп мөлшерде бөліп алу қиын. Сондықтан оның көшірмелерін (молекулаларының саның) жетерліктей көбейту керек. Генді клондау үшін бактериялар қоладнылады. Мысалы, өте жақсы тексерілген, зияны жоқ, кең таралған бактерия – ішек таяқшасы. Керекті ген орналастырылған векторды бактерияға енгізеді. Бактерия тез бөлінетіндіктен, оның ішіндегі вектор да, ген де бактериямен бірге көбейеді. Ақырында өскен бактерия биомассасынан вектор мен ген, яғни рекомбинанттық ДНҚ көп мөлшерде бөлініп алынады.
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 341; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!