Метод формалин-эфирной или уксусной седиментации
В основе методов седиментации (осаждения) лежит разность удельного веса используемых химических реактивов и яиц гельминтов: удельный вес яиц высокий, и они концентрируются в осадке.
Необходимые реактивы и оборудование
Контейнеры (полистироловые) объемом 30 мл с ложечкой для сбора кала
Центрифужные пробирки: пластиковые полипропиленовые или стеклянные объемом 12-15 мл (полипропилен устойчив к воздействию эфира и обладает водоотталкивающими свойствами: легко отделяет детритовую пробку)
Пробки для центрифужных пробирок
Воронки пластиковые или стеклянные диаметром 4 или 5 см
Стеклянные палочки или шпатели
Стаканчики пластиковые или стеклянные, мерные на 50 и 100 мл
Обезжиренные предметные стекла, покровные стекла размером 24 
24 мм
Пипетки или варипипетки с наконечниками
Штативы для центрифужных пробирок
Центрифуга с горизонтальным ротором на 10-12 пробирок
Марля, бинты или мелкоячеистые ситечки металлические или пластиковые
Микроскоп
Формалин концентрированный
Раствор формалина 5-10%-й
Эфир этиловый
Физиологический раствор
Фиксирующий раствор Турдыева
Раствор Люголя 2%-й
Порядок сбора проб кала в консервант
В полистироловые контейнеры с вмонтированной ложечкой наливают 8-10 мл фиксирующего раствора Турдыева (пропись в прилож.8). Ежедневно или с интервалом в 1-2 дня в контейнер добавляют небольшую (объемом с горошину) порцию кала. Объем усредненной пробы кала, помещенной в раствор, не должен превышать 2-3 мл. Материал при каждом добавлении тщательно перемешивают с консервантом и хранят в темном прохладном месте (хранить можно до 2-3 недель). Пациенту рекомендуется не употреблять в пищу грибы, печень, большое количество грубой клетчатки, принимать сорбенты. После масляных клизм и приема бария должно пройти несколько суток. В случае лечения антибиотиками широкого спектра действия или антибактериальными препаратами кал для исследования следует начать собирать спустя 7-10 дней после окончания приема препаратов. Жидкий стул следует собрать однократно в количестве не менее 5 мл в консервант и одновременно доставить в лабораторию пробы кала без консерванта, собранные в этот день в чистую сухую посуду. Особенно это касается случаев "диареи путешественников", вернувшихся из стран тропического и субтропического пояса. Рекомендации по сбору и подготовке материала к исследованию следует вручать пациентам вместе с контейнером.
|
|
|
Подготовка к исследованию препаратов кала, собранного в консервант
1) Тщательно перемешать содержимое контейнера, содержащего трехкратную пробу кала в консерванте, встряхиванием или стеклянной палочкой.
|
|
|
2) В центрифужную пробирку поместить воронку, на неё - 2 слоя марли (можно также использовать металлические или пластмассовые ситечки).
3) Профильтровать не менее 8 мл суспензии из контейнера (если объем фильтрата будет меньше, добавить 10%-й раствор формалина до 8 мл).
4) Долить в пробирку 2 мл эфира и закрыть пробкой.
5) Энергично встряхивать пробирку не менее 30 с.
6) Центрифугировать при 1500 об./мин в течение 2 мин или при 2000 об./мин в течение 1 мин.
7) После центрифугирования образуются 4 слоя: осадок, раствор формалина, коагулированный белок, фекальный детрит- "пробка", а сверху эфир с растворенными в нем жирами.
8) Верхние 3 слоя удалить резким опрокидыванием пробирки (полипропилен легко отделяет "пробку").
9) Препараты микроскопировать при увеличении: объектив 8 или 10, окуляр 7 или 10, для уточнения морфологического строения яиц гельминтов - объектив 40.
10) Просмотр препарата производить без добавления раствора Люголя.
Для продолжения подготовки к исследованию на наличие возбудителей протозойных инфекций необходимо:
1) Осадок суспендировать: одну каплю поместить на предметное стекло, а рядом на вторую каплю нанести 2%-й раствор Люголя. Препараты накрыть покровными стеклами.
|
|
|
2) Микроскопировать сначала при малом увеличении (окуляр 10, объектив 10) - обзорная микроскопия; а затем при увеличении окуляр 10, объектив 40.
3) Метод седиментации для исследования нефиксированного кала (пробы кала без консерванта) на наличие возбудителей протозойных инфекций излагается в разделе 2.
Примечание. В методе формалин-эфирной седиментации формалин можно заменить 5%-м водным раствором уксусной кислоты. Ход исследования остается без изменений.
1.1.1.2.3. Модификация метода седиментации с применением одноразовых концентраторов "PARASEP"
Необходимые реактивы и оборудование
Комплект концентраторов (разборные пластиковые пробирки) 40 шт., содержащие необходимые для работы готовые реактивы
Центрифуга
Микроскоп
Пипетки
Обезжиренные предметные и покровные стекла
Подготовка к исследованию
1) В смесительной камере пробирки-концентратора содержится 2,4 мл 10%-го буферного раствора формалина с 1 каплей тритона-Х-100.
2) Перед взятием пробы добавляют в пробирку 0,9 мл раствора этилацетата (флакон с реактивом прилагается в упаковке с модулями "PARASEP").
|
|
|
3) Пробу кала массой 1,0 г лопаткой-фильтром опускают в полученный раствор.
4) Камеру с образцом присоединяют к пробирке, закрыв замок (закрутить до щелчка). Тщательно встряхивают систему в течение 30 с до получения однородной взвеси.
5) В таком состоянии образец может храниться в течение 24 ч при комнатной температуре (18-24 °С) и до 30 суток в холодильнике (4 °С).
6) После получения взвеси систему переворачивают и конической стороной помещают в центрифугу и центрифугируют при скорости 2500-3000 об./мин в течение 1-3 мин, при скорости 1500 об./мин - 5 мин.
7) В конической части пробирки остается жидкая часть пробы с выделившимися в нее яйцами гельминтов, цистами простейших.
8) Отсоединяют модуль с фильтром (держать строго вертикально!), избегая перемешивания жидкости с осадком. Фильтровальный модуль утилизируется после обеззараживания (кипячением, автоклавированием). Коническая часть пробирки остается для микроскопирования.
9) При образовании "пробки" из этилацетата и жировых частиц необходимое удалить, обведя стеклянной палочкой.
10) Для микроскопирования с помощью пипетки из нижней пробирки на предметное стекло переносят 2 капли пробы осадка.
11) Осадок суспендировать: одна капля осадка помещается на предметное стекло, а во вторую каплю наносится 2%-й раствор Люголя. Препараты накрываются покровными стеклами.
12) Микроскопируют при увеличении: окуляр 10, объективы 10, 40.
13) При использовании для микроскопии рабочей станции FE-5 из процесса исследования можно исключить предметные и покровные стекла.
Примечание. Если пробы кала доставлены в консерванте (например, Турдыева), то их центрифугируют при 1000-1500 об./мин, надосадочную часть сливают. Осадок исследуется согласно пунктам 1-12.
Применение. Метод модификации облегчает визуализацию искомых патогенов, обеспечивает их качественное и количественное определение в субстрате; исключает необходимость приобретения дополнительных реактивов.
1.1.1.2.4. Модификация метода седиментации с применением минисистемы "Real"
Необходимые реактивы и оборудование
Комплект "концентратор-минисистема "Real", содержащий готовые реактивы "Экосаф"
Обезжиренные предметные и покровные стекла
Пипетки
Раствор Люголя 2%-й
Центрифуга
Микроскоп
Подготовка к исследованию
1) Минисистема "Real" состоит из двух герметически соединенных пробирок. Верхняя пробирка содержит 4,0 мл консервирующей смеси "Экосаф", стеклянные бусы и фильтр, в крышку вмонтирована ложечка для сбора кала.
2) В смеси "Экосаф" минисистемы "Real" содержится: ацетат натрия - 0,9%; ледяная уксусная кислота - 2,0%; формальдегид 34-38% - 1,6%; метанол - 0,4%; неионный детергент Тритон Х-100 - 0,16%; дистиллированная вода.
3) Пробу кала объемом одной ложечки минисистемы "Real" помещают в верхнюю пробирку со смесью "Экосаф". Крышка пробирки плотно закручивается.
4) Пробирка минисистемы "Real" с пробой кала энергично встряхивается в течение 30 с до получения однородной взвеси.
5) После получения взвеси пробирка переворачивается верх дном, отвинчивается нижняя крышка и к ней плотно закручивается коническая центрифужная пробирка.
6) Герметически соединенные верхняя и нижняя пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 3 мин при скорости 2000 об./мин.
7) В процессе центрифугирования происходит фильтрация суспензии.
8) В конической части нижней пробирки остается жидкая часть пробы с выделившимися в нее возбудителями кишечных паразитозов.
9) Отсоединяют верхнюю пробирку с фильтром, которая помещается в дезинфекционный раствор для обеззараживания.
10) Для микроскопирования с помощью пипетки из нижней пробирки на предметное стекло переносят 2 капли пробы осадка.
11) Осадок суспендируется: одна капля осадка помещается на предметное стекло, а во вторую каплю наносится 2%-й раствор Люголя. Препараты накрываются покровными стеклами.
12) Микроскопируют при увеличении: окуляр 10, объективы 10, 40.
Примечание. Если пробы кала доставлены в консерванте (например, Турдыева), то отобранную пробу кала центрифугируют при 1000-1500 об./мин, надосадочную часть жидкости сливают. Осадок исследуется согласно пп.3-11.
Применение. Модифицированный метод седиментации с применением минисистемы "Real" имеет все преимущества методов седиментации. Дополнительным преимуществом метода является отсутствие летучих ингредиентов в составе реактива "Экосаф".
Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 889; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!