ДОКТОР, ВЫ ПРОГОНИТЕ МЕНЯ, ЕСЛИ МНЕ НЕ СТАНЕТ ЛУЧШЕ? 23 страница
Для определения такого пропавшего участка хромосомы Дрые нужны были своего рода структурные вешки по всей длине тринадцатой хромосомы — выстроенные вдоль хромосомы маленькие кусочки ДНК, называемые пробами. Дрыя использовал эти кусочки в такой же «склеивающей» реакции, что проводил Бишоп в 1970-х годах: если в опухолевой ДНК есть парный участок, то пробный кусочек ДНК приклеится к нему, если же нет — не приклеится. Дрыя собрал серию таких проб. Вдобавок он уже располагал и вторым необходимым ресурсом — огромной коллекцией замороженных опухолей. Шансы найти совпадающую в обеих хромосомах делецию были ничтожны, так что предстояло проверить множество образцов.
В этом и состояло главнейшее преимущество Дрыи над всеми профессиональными лабораториями Бостона и Хьюстона. Лабораторные исследователи редко покидают свои лаборатории в поисках человеческих образцов, однако у клинициста Дрыи ими был полон холодильник. «Я одержимо запасал опухоли, — рассказывал он с детским восторгом коллекционера. — Распространил среди врачей и пациентов весть, что я интересуюсь случаями ретинобластомы. Каждый раз, как кто-нибудь сталкивался с ретинобластомой, он тут же говорил: „Позовите-ка Дрыю“. Я немедленно приезжал, прилетал или хоть пешком приходил и забирал себе образец. Всех пациентов я знал поименно. Поскольку ретинобластома — семейное заболевание, я звонил им домой, интересовался, не обнаружилось ли ретинобластомы у кого-нибудь из братьев и сестер или еще каких родственников. Иногда я узнавал про опухоль раньше семейного доктора».
|
|
|
Неделя за неделей Дрыя извлекал из образцов хромосомы и при помощи проб ДНК анализировал их структуру. Если проба связывалась с хромосомой, на геле оставался след, если этого кусочка не было — не было и сигнала. Как-то утром, прогнав на анализ очередную дюжину опухолей, Дрыя пришел в лабораторию и, держа блот на просвет у окна, с привычным автоматизмом пробегал глазами ряд за рядом, точно читающий нотные записи пианист. В опухоли, результаты которой он смотрел, в обеих хромосомах недоставало одной и той же пробы — он назвал ее НЗ-8. На миг Дрыю бросило в жар от восторга, но тот быстро сменился дурнотой. «Тогда-то я и осознал: ген у нас в руках. Мы нашли ретинобластому».
Дрыя определил участок ДНК, отсутствующий в обеих хромосомах. Далее требовалось найти соответствующий участок, присутствующий в нормальных клетках, и таким образом выделить ген Rb. Приближаясь к концу исследований, Дрыя напоминал акробата на последнем, самом опасном отрезке каната. Крошечная лаборатория гудела от напряжения, работая на пределе. Дрые не хватало ни технических средств, ни опыта и умений по части выделения генов. Ему отчаянно требовалась помощь на этом последнем броске. Исследователи в лаборатории Вайнберга тоже охотились за геном ретинобластомы. Перед Дрыей стоял простой выбор: скооперироваться с Вайнбергом или же попытаться выделить ген самому — и проиграть.
|
|
|
В вайнбергской лаборатории выделением гена Rb занимался Стив Френд. Веселый молекулярный генетик, наделенный быстрым умом и непринужденной легкостью в общении, Френд как-то вскользь упомянул Дрые, что тоже интересуется Rb. В отличие от Дрыи, работавшего с пополняющейся коллекцией опухолевых тканей, Френд наращивал коллекцию нормальных клеток, в которых ген Rb был цел и невредим. Подход Френда состоял в том, чтобы найти гены, присутствующие в нормальных клетках сетчатки глаза, а потом выявить, какой из них будет деформирован в ретинобластоме, — то есть он двигался навстречу Дрые с другого конца пути.
Для Дрыи было очевидно, что эти два подхода идеально дополняют друг друга. Он определил участок ДНК, отсутствующий в опухолях. Сумеют ли Френд с Вайнбергом вытащить из нормальной клетки целый полноразмерный ген? Исследователи договорились о сотрудничестве между лабораториями. Однажды утром 1985 года Дрыя взял пробу НЗ-8 и бегом бросился через мост Лонгфелло, ставший основной трассой онкогенеза, спеша принести образец на лабораторный стол в институте Уайтхед.
|
|
|
Френду не потребовалось много времени, чтобы проверить пробу Дрыи. При помощи все той же «склеивающей» реакции ДНК он выявил и выделил из нормальной клетки ген, реагировавший на пробу НЗ-8. Этот изолированный ген, как и предсказывалось, обитал в тринадцатой хромосоме. Проверив ген на своем банке опухолевых образцов, Дрыя обнаружил то, что предположил Кнудсон более десяти лет назад: все клетки ретинобластомы обладали неисправными генами в обеих сестринских хромосомах — два удара, — тогда как у нормальных клеток было по две нормальных копии гена. Ген, выделенный Френдом, без всяких сомнений, оказался именно искомым Rb.
В октябре 1986 года Френд, Вайнберг и Дрыя опубликовали результаты в журнале «Нейчур». Статья идеально дополняла предыдущую статью Вайнберга о гене ras — как инь и ян: выделение активированного протоонкогена (ras) и выявление антионкогена (Rb). «Пятнадцать лет назад, — писал Вайнберг, — Кнудсон обеспечил теоретическую базу опухолегенеза ретинобластомы, предположив, что для развития опухоли требуется как минимум два генетических события… Мы выделили (человеческий ген), по всей вероятности, представляющий собой один из примеров подобных генов-супрессоров опухоли».
|
|
|
Функции гена Rb в нормальных клетках и по сей день остаются загадкой. Как оказалось, название этому гену дали не совсем подходящее. Ген ретинобластомы, Rb, мутирован не только в редкой глазной опухоли у детей. В начале 1990-х годов, проверив выделенный Дрыей. Френдом и Вайнбергом ген на множестве других типов рака, исследователи обнаружили, что он мутирован еще и при раке легких, костной ткани, пищевода, молочной железы и мочевого пузыря у взрослых. Подобно гену ras, он экспрессируется практически в любой делящейся клетке — и инактивирован при огромном множестве различных злокачественных заболеваний. Таким образом, название «ген ретинобластомы» не отражает все значение этого гена.
Ген ретинобластомы кодирует белок, также получивший название Rb и обладающий глубоким молекулярным «карманом». Главная его функция состоит в том, чтобы связывать другие белки и хранить их в своем кармане, тем самым не позволяя им активировать деление клетки. Когда клетка решает, что настало время для деления, она присоединяет к Rb фосфатную группу — этот молекулярный сигнал инактивирует белок и заставляет его выпустить из кармана заточенные там другие белки. Таким образом, Rb выступает при клеточном делении в роли привратника, открывающего шлюзы целого потока ключевых молекулярных событий всякий раз, как деление активируется, и закрывающего эти шлюзы, когда деление завершено. Мутация по гену Rb инактивирует эти функции. В раковой клетке шлюзы открыты все время, а потому она не может прекратить деление.
Клонирование ras и Rb — онкогена и антионкогена — стало переломным моментом в генетике рака. За следующие десять лет, с 1983 по 1993 год, в раковых клетках человека выявили множество других онкогенов и антионкогенов (супрессоров опухолей): myc, neu, fos, ret, akt (онкогены) и р53, VHL, АРС (супрессоры опухолей). Ретровирусы, случайные переносчики онкогенов, отошли на задний план. Теория Вармуса и Бишопа — что онкогены представляют собой активированные гены нормальных клеток — была доказана для многих форм рака. Также широко применима к раку оказалась и теория двух ударов — что гены-супрессоры опухолей должны быть неисправны в обеих сестринских хромосомах. Постепенно вырисовывалась общая концептуальная основа канцерогенеза. По этой теории, раковая клетка представляет собой сломанный, вырвавшийся из-под контроля механизм, в котором онкогены исполняют роль заевших педалей газа, а супрессоры — отказавших тормозов[34].
В конце 1980-х годов из прошлого вынырнуло еще одно направление исследований, принеся с собой щедрый урожай генов, связанных с раком. Со времен заметки де Гувеа от 1872 года о бразильской семье с наследственным глазным раком генетики обнаружили еще несколько семей, передававших рак в генах. Истории этих семей носили сходный и трагический характер: рак преследовал их из поколения в поколение, возникая у родителей, детей и внуков. Во всех семейных историях особенно выделялись две черты. Во-первых, генетики заметили, что спектр рака в этих семьях довольно-таки ограничен и стереотипен: в одной семье постоянно встречался рак толстого кишечника и яичников, в другой — молочной железы и яичников, в третьей — саркомы, лейкемии и глиомы. Во-вторых, в разных семьях часто повторялись одни и те же закономерности, наводя на мысль о некоем общем генетическом синдроме. При синдроме Линча, впервые описанном выдающимся онкологом Генри Линчем на примере семьи из Небраски, из поколения в поколение повторялись раки толстого кишечника, яичников, желудка и печени. При синдроме Ли-Фраумени встречались остеосаркомы и саркомы внутренних органов, лейкемии и опухоли мозга.
При помощи самых современных методик молекулярной генетики исследователи 1980–1990-х годов сумели клонировать и определить некоторые из этих связанных с раком генов. Многие из семейных генов рака, подобно Rb, оказались супрессорами опухолей (хотя иногда обнаруживались и онкогены). Большинство таких наследственных синдромов встречалось крайне редко. Однако иной раз генетики обнаруживали ген предрасположенности к раку, представленный в популяции достаточно часто. Пожалуй, самым поразительным из таких открытий стал ген BRCA-1, существование которого заподозрила генетик Мэри Клэр-Кинг, а подтвердила группа Марка Сколника при фармацевтической компании «Мириад дженетик». Этот ген определяет высокую степень риска рака молочной железы и яичников и в некоторых популяциях встречается у одного процента женщин — то есть является самым распространенным геном, связанным с раком у людей. Мы еще вернемся к этому гену чуть позже.
Таким образом, в начале 1990-х годов открытия онкологии перешли от куриных опухолей Рауса к настоящим ракам у человека. Ревнители чистоты жанра все еще продолжали сетовать. Призрак Роберта Коха по-прежнему преследовал генную теорию рака. Кох постулировал, что тот или иной фактор считается причиной болезни тогда и только тогда, если: (1) присутствует в организме больного; (2) его можно выделить из больного организма; и (3) при перенесении из организма больного вторичному хозяину тоже вызывает заболевание. Таким образом, онкогены удовлетворяли двум первым условиям: присутствовали в раковых клетках и могли быть оттуда выделены. Однако никто еще не доказал, что ген рака сам по себе способен вызывать опухоль у животных.
В середине 1980-х годов серия выдающихся экспериментов позволила генетикам рака наконец-то выполнить последнее условие Коха. В 1984 году биологи, работавшие со стволовыми клетками, разработали новую методику, при помощи которой можно было ввести чужеродные гены в мышиный эмбрион на ранней стадии развития, а потом вырастить из этого эмбриона настоящую живую мышь. Таким образом, ученые научились получать трансгенных мышей, у которых один или несколько генов были изменены искусственным образом. Генетики рака ухватились за новые возможности. В число первых генов, введенных таким мышам, вошел и c-myc, онкоген, обнаруженный в клетках лимфомы.
Используя методику выведения трансгенных мышей, группа Филиппа Ледера из Гарварда хитроумным способом изменила у мышей ген c-myc: так чтобы ген повышенно экспрессировался не во всем организме мыши, а только в молочной железе. (Ген myc нельзя активировать во всех клетках, иначе эмбрион превратится в шар беспорядочно делящихся клеток, а потом погибнет. Причины этого непонятны. Единственным способом активировать myc в живой мыши было ограничение активации гена до уровня отдельной ткани. Поскольку лаборатория Ледера изучала рак молочной железы, то он и выбрал именно эту ткань.) Ледер красноречиво назвал полученных им мышей онкомышами и в 1988 году запатентовал их. Мыши стали первым запатентованным животным в истории.
Ледер ожидал, что его трансгенные мыши поголовно заболеют раком, однако, к его удивлению, у онкомышей и рак оказался мышиным. Несмотря на присутствие в хромосомах агрессивного онкогена, у подопытных животных возникали лишь небольшие односторонние опухоли, да и то ближе к концу жизни. Что еще более удивительно, у мышей рак возникал только после беременности. Напрашивалось предположение: для полной трансформации клеток молочной железы требуются не только наследственные факторы, но и факторы окружающей среды, такие как гормоны. «Активного гена myc еще недостаточно для развития опухоли, — писал Ледер. — Будь его достаточно, мы ожидали бы однотипного двустороннего образования опухолевых масс в молочных железах у всех пяти подопытных животных. Однако наши результаты наводят на мысль о двух дополнительных условиях. Одно из них, по всей вероятности, — последующее трансформирующее событие… второе — связанное с беременностью изменение гормонального фона, пока еще только гипотетически предполагаемое на основании этих первых исследований».
Для исследования роли других онкогенов и влияния внешних факторов Ледер создал вторую линию онкомышей, в хромосомы клеток молочной железы у которых были введены два активированных протоонкогена, ras и myc. В считанные месяцы у мышей развились множественные опухоли молочной железы. Таким образом, условие о гормональном фоне, обусловленном беременностью, было частично преодолено. Однако у мышей по-прежнему возникали лишь отдельные отчетливо различимые клоны раковых клеток. У каждой мыши активированными генами ras и myc обладали миллионы клеток молочной железы, получившие мощнейшие онкогены, однако настоящие опухоли дали лишь отдельные клетки.
Все же это был знаковый, эпохальный эксперимент: у животных научились искусственно вызывать рак. «Генетики, — вспоминает ученый Клифф Табин, — пересекли очередную границу. Теперь они не просто возились в лабораториях с генами, путями патогенеза и комками наросшей культуры — теперь они имели дело с настоящими опухолями у животных». Давние придирки Пейтона Рауса — что никто и никогда не сумел получить рак в живом организме, изменив определенный набор генов клетки, — наконец-то утратили былую актуальность и остроту.
Отличительные признаки рака
Я не хочу достичь бессмертия в своих трудах. Я хочу достичь бессмертия не умирая.
Вуди Аллен
Шныряя по клеткам вивария Гарвардского медицинского института, онкомыши Филиппа Ледера несли на своих маленьких лапках огромное научное значение. Эти мыши воплощали достижения онкологической генетики: ученые создали настоящую опухоль в живом организме — не абстрактный очаг деления в чашке Петри — путем искусственного введения двух онкогенов, ras и myc. Однако эксперимент Ледера поднимал множество дальнейших вопросов о генетике рака. Рак — это не просто масса опухолевых клеток в организме. Эта болезнь движется, распространяется, развивается, проникает в новые органы, уничтожает другие ткани и сопротивляется лекарствам. Активация двух сильнодействующих онкогенов не сумела воспроизвести во всех клетках полный набор симптомов рака. Достижения генетики, без сомнения, проиллюстрировали некоторые аспекты развития рака, однако еще многое предстояло открыть.
Если двух онкогенов мало для создания полного спектра рака, то сколько же на самом деле требуется активированных протоонкогенов и дезактивированных супрессоров опухоли? Какие генетические шаги нужны, чтобы превратить нормальную клетку в опухолевую? Применительно к человеческому раку на эти вопросы невозможно ответить экспериментальным путем. Нельзя же искусственно вызывать рак у людей, чтобы на его примере проследить активацию и инактивацию генов! Однако на эти вопросы можно ответить при помощи ретроспективного метода. В 1988 году врач-клиницист Берт Фогельштейн из балтиморского медицинского Института Джонса Хопкинса задался целью определить количество генетических изменений, которое требуется, чтобы вызвать рак у человека. Вопрос этот, в том или ином виде, занимал Фогельштейна почти двадцать лет.
Фогельштейна вдохновили наблюдения, сделанные Георгиосом Папаниколау и Оскаром Ауэрбахом в 1950-е годы. И тот, и другой, работая с различными видами рака, обратили внимание на то, что рак не возникает непосредственно из нормальной клетки. Как правило, он медленно крадется, преодолевая отдельные переходные стадии между полностью нормальной и откровенно злокачественной клеткой. На протяжении десятилетий, перед тем как рак шейки матки достигнет неукротимой инвазивной формы, в тканях можно наблюдать судьбу предраковых клеток, начиная с первых шагов в мрачном движении к недугу. Принцип мазков Папаниколау основан на выявлении и удалении этой предраковой стадии, пока болезнь не достигла стадии злокачественности. Точно так же и Ауэрбах отмечал, что в легких курильщиков предраковые клетки появляются задолго до возникновения самого рака. Рак толстой кишки тоже претерпевает на своем пути серию постепенных изменений — от неинвазивных доброкачественных образований под названием аденома до высокоинвазивной терминальной стадии, инвазивной саркомы.
Фогельштейн решил исследовать этот процесс на примере рака толстой кишки. Он собирал у пациентов образцы тканей, представляющих разные стадии рака толстой кишки. Затем он взял серию из четырех генов рака у человека — как онкогенов, так и супрессоров опухолей — и оценил каждую клиническую стадию из своей коллекции на активацию или инактивацию этих четырех генов[35].
Зная о гетерогенности каждого рака, можно наивно предположить, что у каждого пациента будет наблюдаться собственный набор генетических мутаций, а соответственно — и свой уникальный набор мутировавших генов. Фогельштейн обнаружил в образцах рака толстой кишки поразительно устойчивые закономерности: на примере многих образцов и многих пациентов одни и те же переходные стадии рака сопровождались одними и теми же изменениями генетического состояния. Раковые клетки активировали или инактивировали гены отнюдь не случайным образом. Переход от предраковых стадий к злокачественному инвазивному заболеванию в точности коррелировал со строгой и типичной последовательностью активации и инактивации генов.
В 1988 году Фогельштейн писал в «Нью-Ингленд джорнал оф медесин»: «Параллельно с клинической прогрессией опухоли у больных накапливались четыре молекулярных изменения… По всей видимости, в самом начале процесса одна клетка начинает усиленно делиться и создает маленькое доброкачественное новообразование. Во время роста этих клеток нередко наблюдается мутация в гене ras. И наконец, потеря генов-супрессоров опухолей… может ассоциироваться с перерождением аденомы в саркому».
Поскольку в 1988 году Фогельштейн сам выбирал четыре гена, на активность которых проверял свои образцы, он не мог посчитать общее количество генов, необходимых для полного озлокачествления, — технологиям, позволяющим провести подобный анализ, предстояло появиться только через двадцать лет. Тем не менее он доказал существование постепенного генетического перехода от стадии к стадии. Папаниколау и Ауэрбах описали патологические процессы, сопровождающие наступление рака, как многоступенчатый процесс — от первичных доброкачественных изменений к инвазивному раку. Фогельштейн же продемонстрировал, что генетическое наступление рака тоже является многоступенчатым процессом.
Знать это было приятно. За десять лет, с 1980 по 1990 год, в человеческом геноме обнаружили не меньше сотни протоонкогенов и супрессоров опухолей, и это изобилие порождало тревожный вопрос: если геном человека так густо усыпан всеми этими зловещими генами, только и ждущими возможности подтолкнуть клетку на роковую дорожку, почему же тогда у людей ежеминутно не развивается какой-нибудь новый вид рака?
Генетики, занимающиеся проблемами рака, уже знали ответ на этот вопрос. Во-первых, протоонкогены активируются за счет мутаций, а мутация — не столь уж частое событие. Во-вторых, гены-супрессоры опухолей должны инактивироваться, однако в каждой клетке содержится по две копии каждого гена, а значит, для инактивации гена-супрессора требуется две независимые мутации, что случается еще реже. Фогельштейн дал третий ответ. Активация или инактивация одного гена, постулировал он, обеспечивает лишь первый шаг в процессе канцерогенеза. Наступление рака — процесс медленный и длительный, проходящий через много мутаций во многих генах. Выражаясь в терминах генетики, наши клетки не сидят на краю пропасти, за которым их караулит рак. Они влекутся к этой пропасти постепенно, за много шагов.
Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 64; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!