КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ ЭМБРИОНОВ
Использование технологии криоконсервирования зародышей позволяет сохранить ценный эмбриоматериал при отсутствии животных-реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью.
Технология глубокого замораживания и оттаивания зародышей предусматривает следующие этапы: выбор криопротектора и приготовление криозащитных растворов; качественная оценка зародышей, насыщение их криопротектором; постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей; перенос эмбрионов в жидкий азот и их хранение, оттаивание при определенной температуре; выведение криопротектора из эмбриона; морфологическая оценка зародышей по их пригодности к трансплантации; заправка эмбрионов в пайетты и катетеры; пересадка зародышей реципиентам.
Для криоконсервирования используют свежеполученные эмбрионы только отличного и хорошего качества. Основным условием при этом является сокращение до минимума времени манипуляций с эмбрионами от момента извлечения до замораживания.
Манипуляции по подготовке зигот к криоконсервированию (оценка их жизнеспособности, насыщение эмбрионов криопротектором, заправка в пайетты) проводят в стерильном боксе. Посудой для проводки эмбрионов служат стерильные часовые стекла с лунками и чашки Петри.
Наиболее распространенным криопротектором для замораживания зародышей крупного рогатого скота является 1,4 М (10%-ный) раствор глицерина (ГОСТ 6824-54, ГОСТ 6259-71, ГОСТ 6259-75).
|
|
|
Рабочие растворы криопротектора готовят на основе ФБС (среда Дюльбекко), содержащей 4% сыворотки крови плодов коровы (FS), 100 ед./мл ампициллина и 12 мкг/мл гентамицина (здесь и далее среда). В приведенной ниже схеме (табл. 10) показано приготовление криопротектора глицерина разной концентрации.
В практике криоконсервирования эмбрионов в качестве криопротектора также используется этиленгликоль, схема приготовления которого приведена (табл. 11).
Насыщение эмбрионов криопротектором осуществляется одномоментно (табл. 12).
Таблица 10.
Приготовление растворов глицерина
| Номер раствора | Концентрация раствора, М | Компоненты для приготовления |
| 1 | 1,4 | 1 мл глицерина+9 мл среды |
| 2 | 1,05 | 1 мл 1,4 М р-ра глицерина+1 мл 0,7 М р-ра глицерина |
| 3 | 0,7 | 2 мл 1,4 М р-ра глицерина+2 мл среды |
| 4 | 0,35 | 1 мл 0,7 М р-ра глицерина+1 мл среды |
Таблица 11.
Приготовление 1,5 М раствора этиленгликоля
| Номер раствора | Концентрация раствора, М | Компоненты для приготовления |
| 1 | 1,5 | 0,84 мл этиленгликоля+9,16 мл среды |
Таблица 12.
Одноступенчатое насыщение эмбрионов разными криопротекторами
|
|
|
| Номер раствора | Раствор глицерина | Раствор этиленгликоля | ||
| Концентрация | Время экспозиции, мин. | Концентрация | Время экспозиции, мин. | |
| 1 | 1,4 М | 10 | 1,5 М | 5-10 |
Эмбрионы с помощью микроаспиратора помещают в пайетты, при заправке которых необходимо соблюдать следующую последовательность: в начале набирают последний раствор криопротектора в количестве 2/5 объема, пузырек воздуха, эмбрион в растворе криопротектора (1/5 объема), пузырек воздуха, раствор криопротектора (2/5 объема). Заправку производят таким образом, чтобы верхний столбик раствора криопротектора смочил пыж пайетты (см. приложение). В одну пайетту заправляют не более двух эмбрионов. Нижний конец пайетты закрывают пластиковой пробкой, на которой указывают дату извлечения зародышей, номер донора и номер пайетты. Данные заносят в журнал по замораживанию эмбрионов (см. приложение).
Для замораживания эмбрионов рекомендуется использовать следующие программные замораживатели: ЗЭМ-4 (Украина), Миникул АС-25 (Франция), ЭМБИ-К (Россия). Режимы замораживания приведены в таблице 13.
Таблица 13.
Режим замораживания эмбрионов в 1,4 М растворе глицерине и 1,5 М растворе этиленгликоля
|
|
|
| Этапы работ при криоконсервировании | Замораживатель ЗЭМ-4 | Замораживатель ЭМБИ-К | ||
| 1,4 М глицерин | 1,5 М этиленгликоль | 1,4 М глицерин | 1,5 М этиленгликоль | |
| 1.Время эквилибрации в криопротекторе, мин. | 10 | 5-10 | 10 | 5-10 |
| 2. Заправка эмбрионов в пайетты | Рис.1 | Рис.2 | Рис.1 | Рис.2 |
| 3. Начальная температура охлаждения | +20оС | +20оС | +20оС | +20оС |
| 4. Скорость охлаждения эмбрионов до сидинга | 1оС/мин | 1оС/мин | 1оС/мин | 1оС/мин |
| 5. Сидинг | -7оС | -7оС | -5оС | -5оС |
| 6. Время выдержки после сидинга, мин. | 2 | 2 | 0,2 | 0,2 |
| 7. Скорость охлаждения эмбрионов после сидинга | 0,3оС/мин | 0,3оС/мин | 0,3оС/мин | 0,3оС/мин |
| 8. Конечная температура | -36оС | -36оС | -36оС | -36оС |
| 9. Стабилизация температуры, мин | 30 | 30 | - | - |
| Погружение в азот (-196оС) | Погружение в азот (-196оС) | |||
Пайетты с эмбриоматериалом переносят в камеру для замораживания и включают программу. Снижение температуры происходит автоматически до заданного программой уровня. Затем пайетты переносят в жидкий азот для хранения.
Хранение замороженных эмбрионов осуществляется непосредственно в жидком азоте, в сосуде Дьюара. Используются стандартные канистры для хранения гранул спермы. Для транспортировки эмбрионов в замороженном состоянии применяют сосуды Дьюара емкостью 5 л с аналогичными канистрами.
|
|
|
Для оттаивания замороженных эмбрионов нами предлагается два способа. Первый: оттаивание замороженных пайетт с эмбрионами в водяной бане при температуре +37оС в течение 10-12 сек до полного исчезновения льда. Второй: оттаивание пайетт на воздухе при +20°С в течение 10-12 сек, затем в водяной бане при +25°С также 10-12 сек. Отогретые пайетты освобождаются от маркерной пробки, верхний конец с пыжом отрезают и ее содержимое помещают на часовое отекло. Под микроскопом проводят подсчет количества оттаянных эмбрионов и предварительную морфологическую оценку. После этого эмбрионы отмывают от криопротектора (таблица 14). Перенос эмбрионов из одного раствора в другой проводят стерильными микропипетками под микроскопом при 12-16-кратном увеличении.
Таблица 14.
Удаление криопротектора
| № раствора | 1,4 М р-р глицерина | 1,5 М р-р этиленгликоля | ||
| Концентрация | Время экспозиции, мин | Концентрация | Время экспозиции, мин | |
| 1 | 1,05 | 5 | - | - |
| 2 | 0,7 | 5 | - | - |
| 3 | 0,35 | 5 | - | - |
| 4 | среда | 5 | среда | 5 |
| 5 | среда | 5 | среда | 5 |
После морфологической оценки зародыши заправляют в пайетты и производят пересадку подготовленным реципиентам (см. приложение рис.3).
В последнее время эффективным является использование сахарозы для выведения глицерина из клеток зародышей, что повышает сохранность и приживляемость эмбрионов. Приготовление такого раствора представлено на схеме. После выдержки на воздухе и оттаивания в водяной бане зародыши последовательно помешают в растворы (таблица 15).
Таблица 15.
Приготовление и выведение криопротектора с использованием раствора сахарозы
| Растворы | Время экспозиции, мин. | |||
| Исходные | Рабочие | |||
| № раствора | Компоненты | № раствора | Компоненты | |
| 1 | 1,4 М р-р глицерина:1 мл глицерина+9 мл среды | 1 | 0,7 М глицерин+0,7М сахароза (исходные растворы 1 и 2 смешать 1:1) | 5 |
| 2 | 1,4 М р-р сахарозы: 4,792 г сахарозы+10 мл среды | 2 | 0,7 М сахароза (исходные растворы 2 и 3 смешать 1:1) | 5 |
| 3 | Среда | 3 | Исходный раствор №3 | 5 |
| 4 | Среда | 3 | Исходный раствор №3 | 5 |
После выдержки в последнем растворе эмбрионы оценивают под микроскопом при увеличении в 100-120 раз. Жизнеспособные эмбрионы заправляют в пайетты, затем помещают их в катетер и пересаживают реципиентам. Данные морфологической оценки замороженно-оттаянных эмбрионов и их пересадки заносят в журнал.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 340; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!