НЕХИРУРГИЧЕСКОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 5Следующая ⇒

Техника нехирургического извлечения эмбрионов включает предварительную оценку половых органов донора (наличие и подсчет желтых тел на каждом из яичников, определение состояния матки и размеров ее рогов). Эмбрионы извлекают на 7-й день после осеменения суперовулирующих доноров. Перед извлечением эмбрионов животное фиксируют в станке, прямую кишку освобождают от фекальных масс. Наружные половые органы и перинеальную область тщательно моют теплой водой с мылом, осушают салфеткой, а затем дезинфицируют специальными аэрозолями. Эпидурально вводят 5-7 мл 2%-го раствора новокаина для предотвращения акта дефекации и снятия напряжения гладкой мускулатуры прямой кишки. Строптивым коровам вводят внутримышечно 10-15 мл аминазина с целью снятия стресса. Катетер, предназначенный для извлечения эмбрионов, должен быть стерильным. Перед употреблением в полость катетера вставляют металлический стилет, жестко соединяют с переходником, защищают санитарным чехлом. Инструмент, готовый к работе, орошают аэрозолем «силикон». Раздвигают вульву. Катетер осторожно вводят во влагалище под углом 35-40° таким образом, чтобы он не попал в мочеиспускательный канал. Под ректальным контролем катетер осторожно проводят к шейке матки, прорывают защитный чехол и, осторожно манипулируя шейкой, проводят инструмент в тело матки, направляя его в один из рогов. Дойдя до изгиба рога, отстегивают стилет и извлекают его из катетера на 10 см, затем продвигают катетер за изгиб рога (наиболее оптимальный вариант введения катетера на глубину 15-20 см от маточно-трубного сочленения), подают в баллончик 15-20 см³ воздуха и определяют его местонахождение в роге, извлекают стилет и присоединяют систему для извлечения эмбрионов. Промывная среда в рог матки подается порциями (по 50-60 см³). После ее подачи рог матки поднимают за верхушку, осторожно оттягивают вдоль брюшной полости и слегка массажируют. В этот период промывная среда через отверстие в катетере поступает внутрь его и самотеком попадает в стерильный цилиндр для сбора жидкости. Эту процедуру выполняют 8-10 раз. Обычно на промывание одного рога матки нужно 500 мл среды. Процесс извлечения эмбрионов контролируется ректально.

После завершения промывания одного из рогов подают 60 см³ воздуха для полного удаления жидкости из рога и всей системы, выпускают воздух из баллончика, извлекают катетер. Другой стерильный катетер вводят аналогичным образом в противоположный рог матки, и процедура повторяется. После промывания рога матки среду передают в стерильный бокс для поиска и оценки качества эмбрионов. Катетер после промывания извлекают до бифуркации, а в полость матки вводят смесь антибиотиков (пенициллин + стрептомицин по 1 млн. МЕ в 40-50 мл среды Дюльбекко).

Для извлечения эмбрионов нехирургическим методом используют двухканальные катетеры фирмы «Нойштадт» (Германия) и трехканальные фирмы «Кассу» (Франция).

Для работы в условиях фермы БелНИИЖем предложена закрытая система извлечения эмбрионов с использованием двухканальных катетеров разных модификаций. Принцип работы системы в том, что среда для извлечения эмбрионов подается в рог матки одним шприцем, а удаление ее осуществляется самотеком через силиконовую трубку путем открытия специального клапана. При этом увеличивается производительность труда в 1,5-2 раза и снижается бактериальная обсемененность промывной среды.

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ, ИХ КРАТКОВРЕМЕННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Оценку биологической полноценности эмбрионов крупного рогатого скота можно проводить несколькими методами: морфологически, с использованием витальных красителей, культивированием. Наибольшее распространение получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации зародышей зависят от того, насколько полно оценена их жизнеспособность. Работу с эмбрионами проводят в стерильных условиях в специальном помещении - боксе при температуре воздуха + 22 - +25°С. Стерильность в боксе и предбокснике поддерживается при помощи бактерицидных ламп. Для работы используются заранее подготовленные стерильные посуда, одежда, обувь. Непосредственно перед работой 96%-м этиловым спиртом обрабатывают поверхность рабочих столов и микроскопов. Руки обрабатывают 70%-м раствором спирта.

Качество эмбрионов оценивают в следующей последовательности: после промывания рогов матки коровы-донора флаконы с промывной жидкостью через специальное окошко передаются в бокс. Затем их помещают на неподвижную поверхность для осаждения эмбрионов. Через 20-30 мин. с помощью сифона или шприца с длинной иглой аккуратно отсасывают верхний слой жидкости, оставляя 70-100 мл с осевшими эмбрионами. Отстой разливают в 2-3 чашки Петри (дно чашки предварительно расчерчивают на квадраты 1х1 см для облегчения поиска эмбрионов), затем исследуют под бинокулярной лупой при 15-20 кратном увеличении. После просмотра жидкости в одной плоскости необходимо сделать несколько круговых движений чашкой Петри с целью исключения потери эмбрионов, прилипших к боковым стенкам. Обнаруженные эмбрионы стерильной пипеткой переносят в часовые стекла или маленькие чашки Петри (d 40мм) в 1 мл питательной среды для кратковременного культивирования. В состав среды входят фосфатно-солевой раствор Дюльбекко (можно также использовать среды ТС-199, Игла, гемогидролизат), 24% эмбриональной сыворотки и антибиотики (12 мкг/мл гентамицина и 100 ед./мл ампициллина). После этого эмбрионы оцениваются под микроскопом в проходящем свете при 100-120 кратном увеличении. Основными критериями, по которым производится оценка качества эмбрионов, являются: определение стадии их развития, соответствие уровня дробления возрасту от оплодотворения до извлечения, целостность и форма оболочки, размеры бластомеров и связь между ними. Биологически полноценными считаются эмбрионы, имеющие правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, прозрачную неповрежденную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. Пригодные к пересадке эмбрионы на 7-8-й день после осеменения соответствуют стадиям развития: ранняя и поздняя морула, ранняя и поздняя бластоциста. Для ранней морулы характерно наличие 16-32 бластомеров. Бластомеры разной величины, набухшие, перивителлиновое пространство свободно от отдельных бластомеров. У поздней морулы число бластомеров увеличивается до 32-64. Краевые бластомеры равной величины, завершено уплотнение между бластомерами, отсутствуют разрывы связей между ними.

Для эмбрионов, полученных от коров-доноров мясных пород характерно наличие несколько ослабленной связи между бластомерами. Эмбриональная масса у морул занимает 60-70% перивителлинового пространства, не имеющего других включений.

Для ранней бластоцисты характерно наличие 64-130 бластомеров. На этой стадии образуются трофобласт и бластополость. Перивителлиновое пространство еще различается. Поздняя бластоциста имеет более 130 бластомеров с четко выраженной бластополостью. Эмбриобласт локализирован и отчетливо виден. Трофобласт непрерывный. Зона пеллюцида утончена. Перивителлиновое пространство отсутствует.

Эмбрионы с асинхронным дроблением, с бластомерами разной величины, с повреждением прозрачной оболочки, с лизисом бластомеров и нарушением связи между ними, а также с агглютинацией (разрушением) цитоплазмы, множественными включениями в перивителлиновом пространстве не пригодны для трансплантации. Для неоплодотворенной яйцеклетки характерна однородность клеточной массы, округлая форма, отсутствие бластомеров.

Для морфологической оценки качества морул и бластоцист рекомендуется 5-ти бальная шкала: отличные - эмбрионы сферической формы, стадия развития соответствует возрасту, зародышевые клетки однородные по размеру и цвету; хорошие - эмбрионы соответствуют стадии развития, но имеются небольшие отклонения: неправильная форма, наличие незначительных включений в перивителлиновом пространства, выделение одного или нескольких бластомеров, увеличение перивителлинового пространства; удовлетворительные - эмбрионы имеют клетки со структурными отклонениями, деформированные бластомеры, в перивитиллиновом пространстве мертвые клетки; условно-годные - эмбрионы с деформированной прозрачной оболочкой, частичным разрушением бластомеров, нарушением связи между ними, фрагментацией цитоплазмы, сжатием бластомеров; неудовлетворительные – эмбрионы, отстающие в развитии, со структурными нарушениями, имеющие клетки разного размера, дефекты прозрачной оболочки (сколы, трещины), содержат включения в перивителлиновом пространстве.

Манипуляции с эмбрионами с момента их получения до пересадки или криоконсервирования занимают от одного до семи часов. В течение этого времени необходимо создать условия, обеспечивающие сохранение жизнеспособности эмбрионов. Кроме того, продолжение развития зародышей при кратковременном культивировании является дополнительным тестом в их морфологической оценке.

Культивирование эмбрионов проводят в часовых стеклах в 0,5-1 мл культуральной среды, помещенных в чашки Петри, в термостате при +37°С во влажной атмосфере и при постоянном составе газовой среды (90% азота, 5% кислорода и 5% углекислого газа). После чего их оценивают на пригодность к пересадке. Эмбрионы, пригодные к эмбриопересадке, помещают в специальные пайетты с помощью микроаспиратора по схеме: среда для культивирования (2,5-3,0 см) - воздушный пузырек - (0,5-0,7 см) - эмбрион со средой (2,0-3,0 см) - воздушный пузырек (0,5-0,7 см) - среда для культивирования (2,5-3,0 см). Пайетта готова для пересадки.

Для транспортировки эмбрионов на большие расстояния их заправляют в пайетты, помещают в специальный контейнер (конструкции Белорусского НИИ животноводства), что обеспечивает их высокую сохранность.

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ И ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА IN VITRO

В настоящее время благодаря достижениям в области биологии размножения открылись новые возможности интенсификации процессов воспроизведения высокоценных генотипов сельскохозяйственных животных на основе культивирования ооцитов, их оплодотворения вне организма и трансплантации полученных таким образом эмбрионов реципиентам.

Яйцеклетки для культивирования получают из яичников коров, убитых на мясокомбинате, методом рассечения фолликулов в среде Хенкса с добавлением 1% фетальной сыворотки, 1 ед/мл гепарина и 5 мкг/мл гентамицина.

Ооцит-кумулюсные комплексы, извлеченные из фолликулов разных стадий развития, обладают неодинаковой способностью к созреванию в культуре. Для оценки их жизнеспособности рекомендуется использовать морфологический, биофизический и цитогенетический методы.

Морфологическую оценку ооцит-кумулюсных комплексов проводят визуально по шкале оценки (таблица 9). Для культивирования вне организма используются ооцит-кумулюсные комплексы, оцененные в 5 или 4 балла, что обеспечивает выход зрелых яйцеклеток через 24 часа культивирования на уровне 73%.

Биофизический способ оценки жизнеспособности ооцит-кумулюсных комплексов перед постановкой их на культивирование предполагает регистрацию физико-химических параметров их жизнедеятельности (ВКП - внутриклеточного потенциала). Все работы по регистрации ВКП должны проводится в условиях стерильного бокса.

В экранированную камеру помещаются бинокулярный микроскоп, три позиционера (микроманипулятора). Один для фиксации микроприсоски, второй для фиксации рабочего микроэлектрода, третий для фиксации индифферентного микроэлектрода. Вне экранированной камеры размещаются микроэлектродный усилитель, который в свою очередь взаимосвязан с осциллографом и самописцем. Непосредственно перед работой все приборы проверяются и настраиваются согласно инструкциям.

Таблица 9.

Шкала морфологической оценки ооцит-кумулюсных комплексов

№ п.п.	Морфологические признаки	Оценка, баллы
1	Многослойный, компактный кумулюс, плотно прилегающий к зоне пеллюцида, ооплазма мелкозернистая, равномерно заполняет прозрачную оболочку, которая равномерна по толщине, опалесцирует, не имеет никаких нарушений, округлая по форме.	5
2	Многослойный компактный или разрыхленный кумулюс, плотно прилегающий к зоне пеллюцида, ооплазма имеет участки гранулярной конденсации, прозрачная оболочка округлая, опалесцирующая, не имеет дефектов, равномерная по толщине.	4
3	Частично отслоившийся кумулюс, ооплазма имеет участки гранулярной конденсации, прозрачная оболочка равномерна по толщине, округлая по форме.	3
4	Ооциты без кумулюса, ооплазма мелкозернистая, равномерно заполняющая зону пеллюцида, прозрачная оболочка округлая, равномерная по толщине.	2

После того как все подготовлено к работе, зародышевые клетки в капле питательной среды помещаются в чашку Петри или на предметное стекло. Под визуальным контролем каждая из них фиксируется с помощью присоски, после чего к ней подводится рабочий микроэлектрод, затем проводится прокол зоны пеллюцида с параллельной фиксацией показателей микроэлектродного усилителя. После регистрации ВКП клетки помещаются в инкубатор. Для культивирования рекомендуется использовать ооцит-кумулюсные комплексы с внутриклеточным потенциалом не ниже 4 мВ, что обеспечивает выход жизнеспособных эмбрионов на уровне 31%. Схематичный набор устройств, применяемых для внутриклеточной регистрации, приведен в приложении (рис. 5).

Цитогенетическая оценка ооцит-кумулюсных комплексов предполагает анализ состояния хроматина в ооцитах перед постановкой их на культивирование по методу Тарковского (1966). Для культивирования рекомендуется использовать популяцию ооцитов, не менее 80% которых находится на стадии диплотены, что обеспечивает выход жизнеспособных эмбрионов на уровне 25,7%.

После оценки жизнеспособности ооцит-кумулюсные комплексы помещают в модифицированную среду ТС-199 (Sigma), содержащую 5% эстральной сыворотки коров, и ставят на культивирование в СО₂-инкубатор при температуре 38^оС, 5% СО₂ и 98%-ной влажности. Через 24 часа проводят оплодотворение. Капацитацию замороженно-оттаянной спермы осуществляют в модифицированном растворе Тироде (Sigma) c концентрацией гепарина 50 мкг/мл. Яйцеклетки помещают в каплю среды для оплодотворения и добавляют суспензию спермиев в концентрации 10⁶/мл. Совместное культивирование яйцеклеток и спермиев осуществляется в течение 18 часов. После оплодотворения зиготы помещают в среду для культивирования ранних эмбрионов, представляющую собой модификацию среды ТС-199 (Sigma), на монослой клеток кумулюса и инкубируют в течение 7-11 дней.

Все манипуляции с яйцеклетками и оценку стадий развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота проводят под бинокулярным микроскопом при увеличении 100 крат. Полученные эмбрионы пересаживают реципиентам. В 1999 году в лаборатории генетики БелНИИЖ получены первые телята in vitro.

НЕХИРУРГИЧЕСКАЯ ПЕРЕСАДКА ЭМБРИОНОВ

Нехирургическая пересадка эмбрионов состоит в основном из трех этапов: подготовки реципиентов к пересадке эмбрионов; пересадки, включающей прохождение с помощью специальных катетеров внутренней полости половых органов от преддверия влагалища до верхушки рога матки; строгого контроля за реципиентом до установления стельности или до выявления охоты. Основным критерием эффективности применения метода трансплантации эмбрионов является их приживляемость после нехирургической пересадки. Этот показатель во многом зависит от качества самих эмбрионов, степени синхронности проявления эструса между донором и реципиентом, квалификации специалиста и условий выполнения работы по пересадке.

Нехирургическую пересадку эмбрионов проводят в период диэструса (7-8-й день). В этот период матка наиболее восприимчива к инфекции. Поэтому при пересадке необходимо строго соблюдать асептику. У реципиента должно быть четко выраженное желтое тело, качество которого определяется непосредственно перед пересадкой и оценивается по трехбалльной шкале: "отличное", "хорошее", "удовлетворительное". Животные, у которых желтые тела отсутствуют или слабо выражены, исключают из числа реципиентов и используют в технологии искусственного осеменения. Отобранных реципиентов фиксируют в станке, наружные половые органы и периниальную область обмывают теплой водой с мылом, вытирают салфеткой, дезинфицируют специальными аэрозолями (септонекс, денсол и др.) или 70%-ным этанолом, делают сакральную анестезию 2%-ным раствором новокаина (5 мл) и внутримышечную инъекцию миорелаксанта ханегифа (10 мл). Реципиентам с легковозбудимым типом нервной деятельности внутримышечно вводят 2,5%-й раствор аминазина в количестве 10-15 мл.

Пересадка эмбрионов выполняется специальными катетерами фирм "Кассу"(Франция) и "Нойштадт"(Германия). Катетеры перед использованием стерилизуются кипячением в течение 30 мин, затем высушиваются и до начала использования хранятся в микробоксе под ультрафиолетовой лампой. Эмбрионы, заправленные в пайетту, (см. приложение, рис.3) помещают в стерильный катетер для пересадки, на который снаружи надевают полиэтиленовый санитарный чехол. Специалист по пересадке эмбрионов рукой в перчатке, увлажненной теплым мыльным раствором, раскрывает у реципиента наружные половые губы, другой рукой вводит катетер во влагалище. Чтобы катетер не попал в мочеиспускательный канал, его сначала продвигают на 10-15 см снизу вверх и вперед под углом 35-40°, а дальше горизонтально до упора в шейку матки. Санитарный чехол прорывают катетером.

Под ректальным контролем катетер продвигают через цервикальный канал. Манипуляция с шейкой матки проводятся осторожно, без резких движений и давления на инструмент. После прохождения цервикального канала катетер вводят в рог матки, на стороне которого имеется хорошо развитое, функционирующее желтое тело. Форма желтого тела должна быть округлой, с четко выраженной на верхушке ямкой в виде грибка. Катетер продвигают как можно ближе к верхушке рога матки, ректально контролируя положение округлой головной части инструмента. Убедившись в правильности расположения инструмента, специалист осторожно выдавливает содержимое пайетты в просвет рога матки. Извлекать катетер из полости матки реципиента необходимо осторожным движением. При повторном использовании инструмента его наружную и внутреннюю поверхность промывают водой, затем 70%-ным этанолом, а остатки спирта смывают раствором Дюльбекко. Катетер отряхивают, остатки влаги удаляют стерильной марлевой салфеткой.

Пересадка эмбрионов должна проводиться быстро и осторожно. Оптимальное время нехирургической пересадки 1-2 мин. После пересадки эмбрионов ведется контроль за проявлением охоты у реципиентов. Через 2-3 месяца после пересадки животных исследуют на стельность.

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 840; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 123 4 5 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!