Метод замораживания-скалывания (замораживании-травления).
Этот метод впервые был предложен Стиром. Замораживание-скалывание – это чисто физический метод, и в нем полностью исключены как химические, так и структурные изменения в ткани, которые обусловлены химической фиксацией, обезвоживанием, заливкой и резкой. Поскольку из ткани не удаляются никакие вещества, не может происходить ее сморщивания.
При обычном замораживании материала свободная вода кристаллизуется в виде включений различной величины в цитоплазме клеток и межклеточных пространствах. При этом возникают повреждения органелл, особенно если материал предварительно не был фиксирован в растворе глутарового альдегида, поэтому перед замораживанием необходимо провести фиксацию материала. Наилучшие результаты замораживания биологического материала без повреждения тонких структур достигаются путем увеличения скорости замораживания и применения криопротекторов.
Основное действие криопротекторов – предварительное замещение воды в объекте. Таким образом криопротекторы ослабляют эффект кристаллизации, изменяя её характер, препятствуют слипанию и денатурации макромолекул, способствуют сохранению целостности мембран клеток. Среди криопротекторов наиболее известны глицерин, ацетон, спирт, диметилсульфоксид, сахара, которые способны проникать в клетку, и некоторые полимерные соединения (поливинилпирролидон, полиэтиленоксид и др.), не проникающие в неё. После пропитывания ткани криопротектором ткань подвергается быстрому замораживанию жидким азотом (-196°С). В результате клетки не повреждаются и выживают независимо от своего происхождения.
|
|
|
После извлечения из жидкого азота объект раскалывают при помощи тонких щипцов, скальпеля и легкого молоточка. Полученные поверхности раскола затем обрабатывают с целью получения реплик (с поверхности снимается отпечаток в виде тонкой плёнки углерода, коллодия, формвара и др., повторяющий рельеф поверхности и рассматривается в просвечивающий электронный микроскоп). Либо поверхности раскола предварительно высушивают и напыляют для исследования в растровом (сканирующем) электронном микроскопе.
Для получения реплик поверхность разлома подвергается действию вакуума (10-6 -10-7 мм рт.ст.). По мере того как вода, перешедшая в стекловидную форму, возгоняется, поверхность разлома как бы «протравливается», так что на ней рельефно выделяются органеллы. На «протравленную» поверхность напыляется покрытие из платины или углерода. Таким образом и формируется реплика исследуемой поверхности. После напыления ткань согревают в дистиллированной воде, и реплика всплывает. Следы органических веществ, остающиеся на реплике, удаляются с помощью трипсина с последующей обработкой серной кислотой или щелочью. После тщательной промывки дистиллированной водой реплику помещают на сетку – теперь она готова для просмотра в электронном микроскопе.
|
|
|
Данный метод позволяет обнаружить такие детали, которые не выявляются при использовании других методов. Разлом, следуя по линии наименьшего сопротивления, имеет тенденцию проходить по естественным поверхностям внутри клеток. Этими естественными поверхностями являются мембраны таких органелл как ядро, аппарат Гольджи, митохондрии. Следовательно, открываются поверхности этих органелл, которые можно детально изучать.
Разрешение, получаемое методом замораживания-скалывания, зависит от вида тяжелого металла, используемого для получения реплики. Так, при получении платино-углеродной реплики разрешение ограничено 20-30Å.
Метод негативного контрастирования.
Присоединение атомов тяжелых металлов к структурным компонентам объекта называется позитивным окрашиванием, так как при этом красится сам объект. Однако если биологический объект погружен в электроноплотное вещество, которое не окрашивает его, а создает вокруг него темный фон, то говорят о негативном окрашивании, или негативном контрастировании. Плотное вещество может также проникать в промежутки между структурными компонентами объекта или ложиться на его наружную поверхность, способствуя таким образом, контрастному выявлению деталей его поверхности. Этот метод был разработан Бреннером и Хорне в 1959г.
|
|
|
Особо широкое распространение для окрашивания по методу негативного контрастирования получил фосфорновольфрамовый натрий. Суспензия исследуемого материала готовится обычно в 1%-ном растворе фосфорновольфрамового натрия, затем суспензия из пульверизатора, либо с помощью микропипетки наносится на поверхность сетки, покрытой коллодием или формваром. Сетки высыхают почти мгновенно, и образуется тонкая пленка красителя, заключающая в себе объект.
Разрешение при негативном окрашивании выше, чем разрешение, получаемое на ультратонких срезах. Предел его составляет около 12 Å и определяется размером частиц высушенного красителя.
III . Метод культуры клеток.
История метода.
Культура клеток - метод длительного сохранения в живом состоянии клеток, тканей. Первые успешные опыты по культуре ткани осуществил в 1907 американский учёный Р. Гаррисон, поместив в каплю лимфы кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки. Клетки зачатка оставались живыми несколько недель, из них вырастали нервные волокна. Первая культура фибробластов была получена в 1943г. – это L-клетки. Из карциномы шейки матки в 1953г. была получена культура Hela.
|
|
|
Культивирование клеток.
Клетки можно культивировать как в стеклянной посуде, так и в пластиковой; но одно из главных условий ведения культуры – стерильность. Клетки прикрепляются к стеклу сосудов (стационарные однослойные культуры) или остаются во взвешенном состоянии во вращающихся сосудах (суспензионные культуры). Флаконы, используемые для культивирования клеток, на «лабораторном» языке называют «матрасами».
Пассирование – процесс пересадки клеток. Необходимо, так как:1) в старом флаконе заканчивается питательная среда; 2) количество клеток значительно увеличивается. Для пассирования необходимо клетки разделить друг от друга и от подложки. Для этого используют:
1) хелаты – вещества, удаляющие кальций: ЭДТА – 0,2% его раствор называется версеном;
2) ферменты: 0,25% раствор трипсина («откусывает» белки).
Первичная культура – культура клеток, полученная непосредственно из ткани или органа организма; как правило, такие культуры сохраняются ограниченное число пассажей. Перевиваемые (стабильные) линии полностью адаптированы к существованию вне организма; их получают из нормальных или раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время. Появление постоянной линии клеток констатируется по следующим морфологическим изменениям: уменьшение размера клеток, снижение адгезивности клеток, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения, а также по: увеличению скорости роста, уменьшению зависимости от сыворотки и от субстрата, увеличению анеуплоидности.
Методика «съема клеток»:
1. Из «матраса» с клетками сливается старая среда.
2. В «матрас» наливается смесь версен:трипсин=3:1 (2мл). Это смесью производится только споласкивание (чтобы удалить остатки сыворотки).
3. Предыдущая смесь сливается и наливается смесь версен:трипсин=3:1 (5мл). «Матрас» ставится в термостат +37°С. время нахождения в термостате зависит от вида культуры.
4. По истечении необходимого времени смесь сливается и в «матрас» наливается 2-3 мл среды, «матрас» встряхивается.
5. Из «матраса» берется проба: в камере Горяева подсчитывается концентрация клеток, находящихся во взвеси. После этого определяется, во сколько надо развести среду, чтобы получилось концентрация 200 000 клеток на 1 мл среды.
6. Клетки переносятся в новый «матрас», в который добавляется 5 мл среды.
Среда.
Параллельно с созданием культур разрабатывались среды, в которых эти культуры будут содержаться. Среда должна обладать следующими характеристиками: иметь большую буферную емкость (чтобы скомпенсировать изменения pH), содержать все необходимые для жизнедеятельности клетки вещества (аминокислоты, микроэлементы и т.п.).
Источником гормонов и факторов роста является сыворотка, добавляемая в среду. Кроме того, сыворотка вносит в среду фибронектин (прикрепляет клетки к субстрату), альбумин, трансферрин (связывает ионы железа и доставляет их к клеткам), минеральные вещества. Сыворотка может быть человеческой, крупного рогатого скота (КРС), лошадиной, северного оленя. В зависимости от того, на какой стадии онтогенеза взяли кровь, сыворотка бывает: эмбриональной, новорожденного, взрослого.
Одной из наиболее распространенной сред является среда №199. Эта среда насыщенная, поэтому возможно ее использование с другими средами. Среда №199 содержит почти все аминокислоты и витамины, предшественники нуклеиновых кислот, факторы роста, липиды. Те элементы, которых нет в среде, восполняются добавлением 5-10% сыворотки.
Виды культур.
v Культура СПЭВ. СПЭВ - культура эмбриональной почки свиньи. Клетки культуры СПЭВ являются трансформированными. Имеют эпителиоподобную морфологию. Характеризуются потерей контактного торможения: способны в культуре образовывать много слоев. Буква «В» в аббревиатуре появилась, так как ткань обрабатывали версеном.
v Культура CHO.
v Культура 3Т3 - культура фибробластов мыши.
v Культура FAF28 – фибробласты китайского хомячка.
IV . Метод радиоавтографии.
Радиоавтография является одним из способов обнаружения «меченых» атомов – радиоактивных изотопов. Принцип ее заключается в том, что, заменяя один из атомов изучаемого вещества соответствующим радионуклидом, тем самым метят данное вещество. Радиоавтография позволяет решать следующие задачи: 1) локальный синтез меченого вещества (ДНК, РНК, полисахариды); 2) динамика синтеза (по числу зерен); 3) транспорт веществ; 4) изучение дифференцировки клеток; 5) определение митотического цикла; 6) отслеживание трансплантированных клеток.
Общие принципы метода.
1. Введение предшественника исследуемого макромолекулярного соединения, один из атомов которого заменен на радиоактивный изотоп. Так, например, у тимидина водород в 5 или 6 положении заменяют на тритий - образуется 3Н-тимидин (см. далее). При работе с культурами клеток радионуклиды вводят в питательную среду. В экспериментах на животных метку чаще всего вводят в кровь, хотя более эффективным может оказаться и местное введение.
2. В процессе жизнедеятельности клетки такое меченое соединение будет включаться в биополимер. Так 3Н-тимидин будет включаться в ДНК при ее синтезе. На этот процесс необходимо время (определенное для каждого типа клеток).
3. По истечении этого времени препарат фиксируют. Фиксатор не должен быть сильным окислителем. Кроме того, препарат обязательно необходимо обработать трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для удаления немеченых предшественников нуклеотидов: ТХУ проводит легкий гидролиз нуклеотидов.
4. Далее, если проводится исследование ткани, то кусочки ткани обезвоживают и заливают по стандартным методикам. Из полученных форм готовят срезы и приклеивают их на стекла.
Если проводится радиоавтографическое исследование культуры клеток, то покровные стекла с выращенными на них клетками после фиксации 2-3 часа промывают в проточной воде, ополаскивают дистиллированной водой, а затем 70% спиртом. Высушивают и оставляют в таком виде на ночь.
5. Следующий этап - покрытие фотоэмульсией. В это время в образце (ткань или культура клеток) идет распад изотопа: β-частицы летят в разных направлениях и попадают в зону фотослоя, активируя в нем зерна бромистого серебра. Покрытые фотоэмульсией препараты хранят в течение определенного срока (зависит от типа ткани) в темном месте.
5. Проявление препарата, в результате которого происходит восстановление серебра.
6. Фиксация для удаления галоидного серебра и атомов брома.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 1233; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!