Дегидратация (обезвоживание).
Для того, чтобы приготовить из фиксированной ткани достаточно тонкие для электронной микроскопии срезы, необходимо пропитать эту ткань материалом для заливки, который будет ее поддерживать и сведет повреждения при резке к минимуму. Среды для заливки, наиболее часто применяемые в электронной микроскопии, не смешиваются с водой. Следовательно, для того чтобы ткань полностью пропиталась заливочной средой, вода в ткани должна быть замещена каким-либо веществом, способным смешиваться с заливочной средой. С этой целью ткань предварительно подвергают обезвоживанию.
Если из фиксатора ткань сразу же перенести в 100%-ный этанол, то могут возникать механические повреждения вследствие изменения поверхностного натяжения и токов, образующихся при смешивании этих жидкостей. Для уменьшения повреждений ткань «проводится» по ряду спиртов возрастающей концентрации: 50% → 60% → 70% → 80% → 96% → 100%. После серии спиртов используется ацетон.
Позитивное контрастирование.
Как правило, при дегидратации материала используют не чистый 70°С спирт, а 1,5% раствор уранилацетата в 70°С спирте. Соли тяжелых металлов, связываясь со структурами клетки, повышают их электронную плотность.
Пропитывание ткани заливочной смесью.
От правильно проведенной заливки материала зависит получение высоко качественных срезов. Для лучшего пропитывания материала заливочной смесью используют предварительное пропитывание ткани в смесях следующей последовательности: ацетон/эпон=3:1→ ацетон/эпон=1:1 → ацетон/эпон=1:3. Далее материал пропитывают в чистом эпоне.
|
|
|
Заливка материала.
Оптимальными средами для заливки биологических материалов являются эпоксидные смолы, в частности, эпон. Применение эпоксидных смол позволило решить ряд проблем. В значительной степени уменьшилось сморщивание и повреждение ткани при полимеризации, перестало быть проблемой образование воздушных пузырьков внутри блока. Кроме того, скорость испарения эпоксидных смол под воздействием электронного луча незначительна. Срезы тканей, заключенных в эпоксидную смолу, достаточно прочны. Однако, в экспериментах на животных показано, что эпоксидные смолы обладают канцерогенными свойствами.
Пропитанный в чистом эпоне материал переносят в капсулы с заливочным эпоном. Далее для полимеризации эти капсулы сначала ставятся в термостат 37° С, а затем – в 60 ° С. таким образом, получаются кусочки ткани, залитые в эпон.
Работа на ультратоме.
Приготовление ультратонких срезов, т.е. срезов, пригодных для исследования в трансмиссионном электронном микроскопе, называют ультратомией. Ультратомия необходима по 2 причинам: 1) электронный пучок не проникает сквозь срезы, толщина которых значительно превышает 100 нм; 2) в толстом срезе компоненты перекрывают друг друга и видны менее четко. Этим объясняется понижение разрешающей способности с увеличением толщины среза.
|
|
|
Непременным условием получения качественных ультратонких срезов является хороший нож (стеклянный или алмазный). Для получения ультратонких срезов применяют специальные приборы, называемые ультратомами. Полученный ранее эпоновый блок закрепляют в специальном держателе и под бинакуляром из ткани, залитой в эпон, вырезают пирамидку. На ультратоме изготавливаются срезы. При оптимальных условиях заливки и выполнения ультратомии не удается получить срезы тоньше 30 нм. Обычная толщина ультратонких срезов 50-100 нм.
Если гистологические срезы располагают на предметных стеклах, то ультратонкие срезы «кладут» на специальные подложки – бленды или сетки. Как бленды, так и сетки имеют диаметр около 0,5 см.
Окрашивание ультратонких срезов.
Следует отметить, что термин «окрашивание» по отношению к ультратонким срезам нельзя считать точным, т.к. изображение их черно-белое. Однако, он широко распространен наряду с более точным термином «контрастирование»,
|
|
|
Как уже отмечалось выше, электронно-микроскопическое изображение создается благодаря рассеиванию образцом пучка электронов. Количество электронов, рассеиваемых каждой точкой объекта, зависит от толщины среза и атомного веса составляющих его атомов. Рассеивание увеличивается пропорционально массе элемента. Биологические образцы состоят главным образом из элементов с низким атомным числом: углерода, водорода, кислорода, азота. Исключение составляют, пожалуй, только эритроциты, содержащие тяжелый элемент – железо. Используемые эпоксидные смолы – это органические вещества, следовательно, они состоят из перечисленных легких элементов. В связи с эти различия в отклонении электронов смолой и образцом, а также отдельными компонентами образца, невелики. Изображения в трансмиссионном электронном микроскопе малоконтрастны.
Для усиления рассеивания электронов в микроскоп вводят атомы тяжелых металлов: осмия, вольфрама, рутения, урана, свинца. Таким образом, изображение в электронном микроскопе представляет собой картину, отражающую распределение атомов тяжелых металлов в структурах образца. Структуры, связавшие большое количество этих атомов, сильнее отклоняют электроны и предоставляются более темными на экране и более светлыми на негативе. Соединения тяжелых металлов в образец вводятся:
|
|
|
1) при фиксации (осмий);
2) при дегридатации (уранилуцетат);
3) в ультратонкие срезы.
Наиболее эффективным способом усиления контраста является окрашивание ультратонких срезов. Для более высокого контрастирования сначала срезы окрашиваются уранилацетатом (40 мин при температуре 37° С). Уранилацетат избирательно контрастирует структуры, содержащие нуклеиновые кислоты. Для окрашивания сетки с ультратонкими срезами просто помещают на поверхность капли раствора красителя. При этом заливочная среда не окрашивается, а окрашивается только ткань.
После обработки срезов уранилацетом используют свинец. Свинец контрастирует многие клеточные компоненты. Наиболее популярно контрастирование свинцом по методу Рейнольдса (1963).
Полученные выше описанным способом сетки с ультратонкими срезами готовы для анализа при помощи трансмиссионного электронного микроскопа.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 512; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!