Подготовка материала к исследованию в трансмиссионной электронной микроскопии.
Занятие № 2 .
Методы клеточной биологии.
II . Электронная микроскопия.
электронная микроскопия.
Трансмиссионная сканирующая (растровая)
Общие требования к исследуемому материалу в сканирующей электронной микроскопии по сути те же, что и в трансмиссионной микроскопии. Однако в трансмиссионной микроскопии важна сохранность архитектоники самого объекта и его внутриклеточных органелл. В методе СЭМ все внимание обращено на поверхность изучаемого объекта и ее сохранность при специальной обработке.
Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ).
Основы конструкции электронного микроскопа. Принцип работы электронного микроскопа.
Уже в 1924г. стало известно, что волновые свойства присущи также и электронам и что длина волны электрона обратно пропорциональна его скорости. Вскоре после этого было установлено, что электронный луч можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Эти два свойства электронного луча послужили основой создания электронного микроскопа, в котором при особых условиях может быть достигнуто минимальное разрешение 2 Å (0,0002 мкм). Основная часть электронного микроскопа представляет собой металлический ряд магнитных линз, люминисцирующий экран и фотографическую пластинку.
В верхней части колонны электронного микроскопа расположена так называемая электронная пушка. Электронная пушка состоит из 3 частей: катода (вольфрамовой проволоки – нити катода, - изогнутой в форме буквы V), защитного экрана катода (имеющего отверстие, расположенного непосредственно под точкой перегиба нити – в «основании» буквы V) и анода. Ток (несколько сот микроампер), проходящий через вольфрамовую нить, нагревает ее. Когда нить раскалится, атомы металла выпускают электроны (термальная эмиссия). Электроны стремятся сконцентрироваться на вершине нити, образуя электронное облачко. На защитном экране катода поддерживается относительно нити отрицательное напряжение в 
несколько сот вольт, что достигается включением сопротивления между экраном и нитью. Этот отрицательный потенциал, обозначаемый как «напряжение смещения», отталкивает электроны, покинувшие нить, от внутренней поверхности защитного экрана и собирает их в области апертурной диафрагмы. Таким образом, защитный экран сам по себе служит слабой линзой, собирающей электроны в небольшое облачко диаметром приблизительно 40-50 мкм. Это облачко представляет собой активный источник электронов, которые вследствие разницы напряжения между нитью и анодной пластиной направляются вниз по колонне микроскопа.
|
|
|
К вольфрамовой нити прилагается высокое отрицательное напряжение, которое и обуславливает большую разницу потенциалов между нитью и заземленной пластиной анода. Напряжение, которое используется в для ускорения электронов, достигает 50 000 – 100 000 В (в микроскопах лаборатории Электронной микроскопии – 80 000 В). Разница потенциалов ускоряет движение электронов по направлению к аноду. Часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и образует электронный луч, направляющийся вниз по колонне микроскопа.
|
|
|
Далее электронный луч фокусируется первой магнитной линзой – конденсорной. Основа магнитной линзы – несколько тысяч витков проволоки, через которую пропускают ток силой 1 А или меньше. Проходящий через катушку ток, создает магнитное поле, которое отклоняет попадающие в него электроны. Для того, чтобы избежать необходимости использовать токи большей силы и создать концентрированное магнитное поле, наружные и внутренние витки катушки упаковываются в железный панцирь, на внутренней стороне которого имеется небольшая кольцевидная щель. Таким образом, все магнитное поле концентрируется внутри этой щели. Электрон, попадающий в магнитное поле, движется по спирали вследствие сложения двух сил: 1) разности потенциалов между катодом и анодом, которая толкает электрон вниз по прямой линии, и 2) магнитного поля, которое заставляет электрон двигаться по окружности под прямым углом к электронно-микроскопической оси. В результате электрон двигается по спирали.
|
|
|
Электронный луч, сфокусированный конденсорной магнитной линзой, освещает объект. Большая часть электронов проходит через объект без отклонения, однако часть электронов рассеивается тяжелыми атомами объекта и выбивается из общего электронного луча. В результате формируется такая структура выходящего луча, которая при повторной фокусировке преобразуется в изображение объекта.
Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой - объективной, которая формирует увеличенное изображение объекта. Для того, чтобы добиться еще большей концентрации поля, в канал объективной линзы помещают железные полюсные наконечники, что позволяет сузить как сам канал, так и кольцевую щель, в которой собственно и происходит концентрация магнитного поля.
Полученное изображение в дальнейшем снова увеличивается третьей магнитной линзой – проекционной – и проецируется на люминесцентный экран. Люминесценция – это способность к электромагнитному излучению под влиянием бомбардировки электромагнитными или электронными лучами. Некоторые вещества при этом излучают видимый свет. Явление люминесценции используют в электронной микроскопии для того, чтобы сделать видимым электронное изображение. С этой целью на пути луча и ставят люминесцентный экран, покрытый люминесцентным веществом, например, сернистым цинком. Под воздействием электронов экран излучает видимый свет. Естественно, что электроны, вышедшие из состава луча, не достигают экрана и те места экрана, которые не подвергаются бомбардировке, остаются темными. Светлые (люминесцирующие) области экрана показывают те места, где электроны смогли пройти сквозь объект и вызвать свечение вещества, покрывающего люминисцентный экран.
|
|
|
Разрешение люминесцентного экрана ограничивается размерами частиц люминесцирующего вещества приблизительно до 70-100 мкм, а также рассеиванием света в слое этого вещества. Изображение можно сфотографировать, если поднять люминесцентный экран с тем, чтобы луч попал на фотографическую пластинку. При фотографировании объектов следует использовать фотопластинки с мелкозернистой эмульсией, которые обеспечивают фиксацию всех деталей электронного изображения.
Следует отметить, что в большинстве современных просвечивающих микроскопах используется две конденсорные линзы (обозначаемые К1 и К2), с тем чтобы получить очень небольшую область интенсивного освещения объекта для работы при больших увеличениях. Функция К1 заключается в том, чтобы уменьшить диаметр изображения эффективного источника электронов с 40-50 до 1 мкм или менее. Такое уменьшенное изображение проецируется затем на объект с помощью второй конденсорной линзы К2. Это дает возможность по желанию освещать очень небольшие участки объекта и избежать тем самым повреждения лучом других его частей. Размеры проецируемого изображения источника электронов можно произвольно изменять, увеличивая или уменьшая силу тока в катушке конденсорной линзы К2.
Кроме того, обычно имеются также 2 проекционные линзы (П1, которая иногда называется промежуточной линзой, и П2), что позволяет получить большое увеличение конечного изображения при относительно небольшой длине колонны микроскопа.
Вакуумная система микроскопа.
В воздухе электроны могут проходить лишь несколько микрометров, а затем они либо останавливаются, либо скорость их снижается в результате столкновения с молекулами газов, содержащихся в воздухе. Поскольку расстояние между электронной пушкой и фотографической пластинкой составляет приблизительно 1м, внутри микроскопа необходимо создать вакуум. Рабочий вакуум должен быть не менее 10-4 мм рт.ст. (как правило, 10-5 - 10-6 мм рт.ст.). В этих условиях электрон может пройти 2,5 м, прежде чем он столкнется с молекулой газа.
Кроме того, если между нитью катода и анодом содержаться молекулы газа, то эти молекулы под влиянием бомбардировки электронами легко превращаются в положительно заряженные ионы. Такие заряженные ионы настолько сильно увеличивают проводимость между катодом и анодом, что создаются условия для возникновения непрерывных электрических разрядов вместо постоянного потока электронов. При работе на микроскопе с «плохим» вакуумом значительно снижается срок службы катода.
Для поддержания требуемого вакуума необходимы вакуумные насосы двух типов. С помощью ротационного механического форвакуумного насоса осуществляют первую, предварительную откачку (до 10-2 мм рт.ст.). Далее включают насос второго типа (диффузионный).
Система охлаждения микроскопа.
При работе электронного микроскопа диффузионный насос и магнитные линзы охлаждаются водой, циркулирующей в специально охлажденной рубашке. При употреблении для этой цели нефильтрованной водопроводной воды может произойти быстрое засорение системы охлаждения микроскопа. Чтобы избежать частой смены и чистки фильтров, многие микроскопы снабжены встроенной системой повторной циркуляции деионизированной или дистиллированной.
Подготовка материала к исследованию в трансмиссионной электронной микроскопии.
1. Взятие материала для фиксации.
Кусочки органа или ткани сразу же после иссечения у животного помещают на пробку или фильтровальную бумагу, смоченную фиксатором. С помощью пинцета и лезвия из небольших кусочков аккуратно нарезают кусочки размером не более 1-1,5 мм3. Очень важно, чтобы кусочки имели размер не выше указанного: в противном случае их внутренние части будут фиксированы не полностью или совсем не фиксированы. Нарезанные кусочки быстро перемещают в фиксирующую жидкость.
Фиксация.
Цели фиксации: 1) остановить посмертные изменения, 2) сохранить ткань в состоянии, по возможности наиболее близком к прижизненному. Фиксирующие вещества, используемые в электронной микроскопии, применяются обычно в водных растворах (величина pH этих растворов поддерживается на уровне физиологических значений при помощи буфера).
Для фиксации обычно используют 2,5% глутаровый альдегид. Этот метод предложен в 1963г. D.Sabatini и соавт. Действие фиксатора условно сводится к образованию связей между молекулами клеточных мембран и мембран органелл в прочную единую сеть. Альдегиды в основном активно «сшивают» клеточные белки. Глутаровый альдегид обеспечивает лучшую сохранность морфологических образований в поверхностном слое клеток, а также тонких внутриклеточных структур. Кроме того, глутаровый альдегид относительно быстро проникает в ткани. Вдыхать пары глутаральдегида не рекомендуется; при попадании на кожу он может вызвать дерматит.
Постфиксация.
При альдегидной фиксации ненасыщенные липиды и фосфолипипиды не стабилизируются, для их сохранения требуется дополнительная фиксация («постфиксация»). Для этого используют 1% раствор тетраоксида осмия (OsO4). Осмиевые фиксаторы прежде всего взаимодействует с липидами и беками по месту двойных связей. Нуклеиновые кислоты и углеводы почти не взаимодействуют с тетраоксидом осмия, если они не связаны с белками. Раствор тетраоксида осмия очень медленно проникает в ткань (0,75 мм/час), поэтому продолжительность фиксации кусочка ткани размером 1 мм3 составляет 60-90 мин. Пары четырехокиси осмия раздражают дыхательные пути и могут вызвать тяжелые поражения глаз.
Сочетание первичной фиксации глутаровым альдегидом с последующей дополнительной фиксацией в четырехокиси осмия получило название метода «двойной фиксации». В настоящее время это наиболее распространенный метод сохранения ткани. Этот метод сочетает в себе преимущества 2 фиксаторов: сохраняются и белки, и липиды.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 912; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!