Прямой ИФА, определение, метод проведения.
Иммуноферментный анализ ( ИФА-диагностика ) — современный метод лабораторного диагностирования, который идентифицирует специфические антитела крови и антигены определенной болезни.
В прямом иммуноферментном анализе вносимый материал (антиген) закрепляется во время инкубации на поверхности чистых лунок. Количество исследуемого материала детектируется с помощью антител к выявляемому антигену, соединенных со специфической меткой, обеспечивающий ферментативную реакцию.
Принцип прямого ИФА
· разноцветные круги — различные антигены из внесённой в лунку сыворотки;
· Y с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).
Структура анализа.
Биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) помещается в чистые лунки на некоторое время (обычно 15—30 минут), достаточное, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок.
Далее в лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4—5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном. Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними. Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок выливают (или вымывают методом декантации). В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок.
|
|
|
Следующий этап — ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30—60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт).
Краткая схема: (Антиген) → Антитело
Поскольку добавленная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов.
Непрямой ИФА, определение, метод проведения.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антивидовые антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель. Одна из наиболее распространенных схем ИФА.
|
|
|
Принцип непрямого конкурентного ИФА;
· большие жёлтые круги — конъюгат антиген-белок, иммобилизированный на поверхности лунки;
· малые красный, зелёный и синие круги — различные антигены из внесённой в лунку сыворотки (например, наркотические вещества);
· Y — немеченые антитела, специфические к конкретному антигену;
· Y с лиловой точкой — вторичные антивидовые антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).
Структура анализа.
На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют.
После удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых вторичных антивидовых антител.
После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.
Краткая схема: Антиген-К → (Антитело) + Антиген → Антитело-К
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 257; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!