Векторы на основе бактериофагов
При использовании фаговых векторов жизнеспособным продуктом, содержащим рекомбинантную ДНК, является не популяция клеток, как в случае с плазмидными векторами, а популяция фаговых частиц.
Фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, при клонировании крупных вставок.
Самыми распространенными для кишечной палочки являются векторы, сконструированные на основе фагов l и М13. Бактериофаги (фаги) - вирусы, поражающие клетки бактерий.
Могут существовать вне клетки бактерии.
Для репликации должны инфицировать клетку бактерии.
Содержат ДНК или РНК, в одно- или двуцепочечной форме, линейная или кольцевая.
Геном умеренного фага l представлен двухцепочечной ДНК размером 48,5 т. п. н., которая упакована в головку в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами (липкие концы).
После проникновения в клетку липкие концы взаимно спариваются (в cos-сайтах), молекула замыкается в кольцо и сшивается с помощью ДНК-лигазы.
Профаг l в лизогенных клетках находится в интегрированном с нуклеоидом состоянии.
Важными для конструирования векторов являются:
1) вся центральная часть (более 1/3 генома) несущественна для литического цикла, а нужна только для установления лизогенного состояния. Таким образом, ее можно заместить на чужеродную ДНК, и при этом фаг сохранит способность лизировать клетки.
2) для успешной упаковки ДНК в головки фага требуется, чтобы ее длина была более 38 т. п. н., но менее 52 т. п. н.
|
|
|
В настоящее время сконструировано большое количество разнообразных векторов на основе фага l.
Типичные из них содержат сайты рестрикции для Eco RI, ограничивающие участок генома, не нужный для литического цикла. При воздействии рестриктазой Eco RI на ДНК такого вектора образуется 3 фрагмента, среди которых можно отобрать концевые (содержат гены, необходимые для литического цикла) благодаря их сравнительно большим размерам.Эти фрагменты смешивают с чужеродной ДНК, обработанной Eco RI, и получают гибридные молекулы, у которых центральная часть представлена вставочным фрагментом. Полученные гибридные молекулы упаковывают в головки фага l in vitro. Для этого используют культуры клеток E.coli, инфицированные мутантными штаммами фага l, один из которых имеет повреждение в гене, ответственном за процесс упаковки ДНК в головку, а второй — за синтез отдельных белков головки.Такие фаги не способны обусловить литический цикл, но обеспечивают накопление в клетках большого количества промежуточных продуктов, необходимых для сборки фаговых частиц: пустых головок, хвостовых отростков, ферментов, необходимых для сборки.Если экстракты таких клеток смешать с векторной ДНК, содержащей вставки определенной величины, произойдет их упаковка в головки фага и сформируются зрелые фаговые частицы. На следующем этапе этими частицами инфицируют чувствительные клетки и получают потомство фагов с клонированными ДНК. В составе векторов на основе фага l можно клонировать фрагменты длиной до 15 т. п. н
|
|
|
23. Векторы для клонирования в клетках грамположительных бактерий.
Векторы для клонирования в клетках грамположительных бактерий Bacillus subtilis, стрептомицетов, дрожжей Saccharomyces cerevisiae представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в Е. coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены.
Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: В. subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus.
Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов В. subtilis.
Полученные рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам
24. Банки генов и клонотеки геномов.
Банком генов, или библиотекой генома(клонотекой), называют совокупность клонов бактерий или фаговых частиц, в которой содержится, по меньшей мере, по одному экземпляру каждой последовательности генома исследуемого организма.
|
|
|
Необходимое количество клонов в клонотеке определяется отношением размера генома и размеров клонируемых фрагментов ДНК.
Наиболее часто используются два типа клонотек: геномные библиотеки и библиотеки кДНК.
Геномные библиотекипредставляют собой собрание генов и последовательностей ДНК какого-то организма. Их получают обычно с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага l или космид. Эти векторы характеризуются большой емкостью, что позволяет уменьшить число клонов в клонотеке.
Библиотека кДНКпредставлена набором клонов, содержащих двухнитевые ДНК-копии всех мРНК клетки. Для создания этих клонотек чаще используют плазмидные или фаговые (на основе фага l) векторы.
Идентификация генов в клонотеке генома.
Идентификация генов в клонотеке генома.
Проводят анализ самой вставочной полинуклеотидной последовательности либо продуктов ее экспрессии в клетках-хозяевах.
1) Использование зондов, комплементарных определенным участкам генов или кДНК.
2) Скрининг основан на изменении фенотипа клеток, воспринявших определенный фрагмент ДНК, вновь синтезированного белка
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 1788; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!