Характерные свойства векторов молекулярного клонирования
Векторами для молекулярного клонированияявляются молекулы ДНК, которые могут доставлять в клетку-хозяина чужеродную ДНК.
Векторами для клонированияявляются:
Плазмиды – кольцевые двухцепочечные экстрахромосомные самореплицирующиеся молекулы ДНК бактерий. В плазмидах клонируют фрагменты ДНК до 10 т.п.н.
Фаги. Первыми были разработаны векторы на основе фага λ E. coli. ДНК фага λ составляет примерно 50 т.п.н. Значительная часть (20т.п.н.) несущественна для размножения фага и может быть заменена на чужеродную ДНК. В фаге можно клонировать фрагмент ДНК до 20т.п.н. Космиды– векторы, объединяющие в себе свойства плазмиды и фага. Созданы искусственно. Могут амплифицироваться в бактерии как плазмиды и упаковываться в фаговые головки. Могут включать вставку чужеродной ДНК до 40т.п.н.
Искусственная дрожжевая хромосома (yeast artificial chromosome –YAC). Вектор разработан на основе ДНК дрожжей. Применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (от 100 до 1000 т.п.н.) эукариот.
Характерные свойства векторов молекулярного клонирования
1) вектор должен реплицироваться в клетке-хозяине;
2) вектор должен иметь один или несколько селективных маркеров (генов), позволяющих легко отличить клетки, несущие вектор, от нетрансформированных клеток;
3) вектор должен содержать максимальное число уникальных сайтов рестрикции, в которые может быть осуществлена вставка гетерологичной ДНК;
|
|
|
4) идеальный вектор должен дополнительно содержать маркер, который может быть активирован или инактивирован путем встраивания фрагментов гетерологичной ДНК;
5) вектор должен быть небольшим, так как эффективность трансформации клеток-хозяев снижается по мере увеличения раз- мера плазмиды до 15 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.) и выше;
6) вектор должен быть хорошо охарактеризован относительно числа генов и их расположения, а также сайтов рестрикции и нуклеотидной последовательности
Векторы на основе плазмид.
Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды.
Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно наследуемые.
Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По размеру они соответствуют 1 — 3 % генома бактериальной клетки.
Плазмиды разделяют на конъюгативные, способные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъюгации, и не конъюгативные, не обладающие этим свойством.
Плазмиды могут иметь в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), гены, контролирующие катаболизм некоторых органических соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды).
|
|
|
Поскольку эти гены находятся в плазмидах, они представлены гораздо большим числом копий.
Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli.
Эта плазмида содержит гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, причем в генах устойчивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции.
Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется.
Успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов можно определить по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику.
Таким образом вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду. Место начала репликации должно обеспечивать увеличение числа копий этой ДНК в клетке бактерий и тем самым передачу плазмиды в дочерние клетки при размножении бактерий.
Ген устойчивости к антибиотику ампициллину позволяет отобрать те бактерии, в клетках которых имеется плазмида-вектор.
|
|
|
Ген устойчивости к тетрациклину позволит определить, в каких бактериях находится плазмида, имеющая в своем составе фрагмент с клонируемым геном.
Рекомбинантные клетки будут расти на питательной среде с Ap, но не будут на среде с Tc.
В пределах последовательности определяющего устойчивость бактерий к тетрациклину гена имеются места узнавания для нескольких рестриктаз - HindIII, Bam HI и SalI.
При обработке любой из этих рестриктаз ДНК плазмиды-вектора в пределах гена tet появятся «липкие концы», по которым и может произойти встраивание клонируемого фрагмента.
Если встраивание действительно осуществляется, ген тетрациклинустойчивости, оказывается «разорван» встроившимся фрагментом ДНК.
Поэтому содержащие такую плазмиду бактерии уже не могут образовывать кодируемый геном Tet белок и размножаться на среде с тетрациклином
Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом:
1) Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca2+, что делает их мембраны проницаемыми для ДНК.
2) Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды;
|
|
|
3) Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.
4) В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.
Недостаток плазмидных векторов - в снижении числа копий на клетку при увеличении размера гибридной плазмиды. В результате клонирование фрагментов ДНК, превышающих 10 т. п. н., становится малоэффективным.
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 1433; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!