Инструменты генетической инженерии
Инструментами в технологии рекомбинантных ДНКявляются ферменты нуклеинового обмена и, прежде всего, эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы).
В природе рестриктазы являются компонентом системы рестрикции-модификации, которая служит защитным механизмом от чужеродной ДНК у микроорганизмов Все ферменты нуклеинового обменаусловно можно разделить на следующие группы:
используемые для получения фрагментов ДНК (рестриктазы);
синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК (ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы (ревертазы), фосфатазы, полинуклеотидкиназы );
соединяющие фрагменты ДНК (ДНК-лигазы);
позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;
применяемые для приготовления гибридизационных проб.
.В эту систему входят два фермента, специфичных для каждого штамма:
1) ДНК модифицирующий (метилтрансфераза, или метилаза). Метилтрансфераза, метилируя определенный нуклеотид в пределах сайта узнавания, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы.
2) ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции), Рестриктаза расщепляет фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК в определенном месте участка узнавания или рядом с ним при отсутствии специфической модификации Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) II типаузнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи в определенном месте.
|
|
|
18. Метод полимеразной цепной реакции.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)делает возможным быстрый синтез (амплификацию) в пробирке нужных последовательностей из считанных исходных копий.
Для проведения амплификации нужны следующиекомпоненты:
ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);
Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента).
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК)
Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлиннение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК)
Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента) .
ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся стадий реакции (15–30 циклов по 1–3 мин):
1) тепловая денатурация исходной ДНК при ~94 °С;
2) отжиг ДНК-затравок (праймеров) при ~50–60 °С на получившиеся одноцепочечные матрицы;
3) синтез двухцепочечных ДНК при 72 °С с каждым из праймеров навстречу друг другу по противоположным цепям ДНК Реакцию проводят в амплификаторе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок.
|
|
|
По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества исходных копий ДНК в геометрической прогрессии.
Важнейшим компонентом ПЦР являются термостабильные ДНК-полимеразы, способные сохранять активность на протяжении всей реакции ПЦР, несмотря на воздействие высоких температур на стадии тепловой денатурации ДНК.
Применение ПЦР:
Фундаментальная наука и практика
• секвенирование (определение нуклеотидной последовательности )
• клонирование генов
• генная инженерия
• направленный мутагенез.
Клиническая лабораторная диагностика
• диагностика вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половые инфекции и др.)
• диагностика генных болезней (выявление мутаций)
• судебная медицина
Векторные системы, применяемые для клонирования в клетках прокариотических организмов.
Для прокариот сконструированы векторные молекулы - «челночные векторы».
Они способны к репликации в разных клетках-хозяевах, что обеспечивается введением в вектор дополнительных областей начала репликации (ori), а также генов, требуемых для репликации и не поставляемых хозяйскими клетками.
|
|
|
Одни из челночных векторов способны поддерживаться в клетках разных прокариот, другие — в клетках некоторых прокариот и эукариот (дрожжей, растений, животных).
Использование челночных векторов удобно для клонирования генов и анализа их продуктов, поскольку одни и те же гены получают возможность реплицироваться и экспрессироваться в разных организмах
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 1227; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!