Схема бактериологического исследования пищевых продуктов

На парагемолитические вибрионы

Обозначения: п.в. - пептонная вода; ПУС - полиуглеводная среда; ЩА - щелочной агар; ЭС - элективная среда.

 

З А Н Я Т И Е 8

Дата ______________

 

Тема: Санитарно-микробиологическое исследование консервов.

План занятия:

1. Разбор основных правил отбора проб для санитарно-микробиологического исследования консервов.

2. Метод определения доброкачественности консервов (термостатная выдержка).

3. Методы санитарно-микробиологического исследования консервов.

3.1. Определение МАМ и ФАнМ.

3.2. Методы выявления мезофильных анаэробных микроорганизмов.

3.3. Метод определения Bacillus cereus.

3.4. Методы выявления ботулинических токсинов

 и Clostridium botulinum.

3.4.1. Подготовка продукта к испытанию.

3.4.2. Выявление С. botulinum.

3.4.3. Выявление ботулинических токсинов

3.4.4. Серологическое типирование токсина С. botulinum (защитный тест).

3.5. Метод определения Clostridium perfringens.

 

Методические указания

1. Разбор основных правил отбора проб для санитарно-микробиологического исследования консервов

 

Первоначально проверяют состояние тары и отмечают её недостатки - неисправность, отсутствие пломб, наличие плесени, загрязнённости, утечки, отсутствие или неясность маркировки.

Затем устанавливают однородность партии (продукт одного вида и сорта, в таре одного типа и размера, одной даты выработки, изготовленный одним заводом). Все организации, занятые хранением и реализацией консервной продукции, при приёме, хранении и выпуске на довольствие консервов обязаны их сортировать, отбраковывать банки с подтёками, бомбажные, пробитые гвоздями и сильно деформированные.

На каждую выявленную партию непригодных в пищу консервов состав­ляют акт с указанием причин браковки, количества забракованных банок, маркировки. Такие консервы хранят до утилизации или уничтожения в отдельных помещениях на особом учёте.

При пищевых отравлениях консервами отбор проб для анализа проводят в таком количестве, какое необходимо по заключению санитарно-эпидемиологической службы или какое удаётся собрать, включая и недоеденные остатки. В этих случаях отобранные пробы помещают в стерильную посуду вместе с банками и опечатывают или пломбируют.

От партии отбирают исходный образец, из которого формируют среднюю пробу. От пищевых консервированных продуктов, расфасованных в жестяную, стеклянную или полимерную тару вместимостью до 1 дм³, средний образец состоит из трёх единиц упаковки, а вместимостью от 1 до 3 дм³ - из одной упаковки. Если масса (объём) пробы продукта не уста­новлена в нормативно-технической документации на конкретный вид продукции в потребительской таре, то от каждой упаковочной единицы (коробка, ящик), попавшей в выборку, отбирают не менее одной банки.

При отборе проб консервов в жестяной таре необходимо руководс­твоваться действующими требованиями к маркировке указанного вида пищевой продукции. Маркировку условными обозначениями в три ряда по шесть знаков на банки наносят методом выштамповывания или несмываемой краской на внешней стороне дна или крышки банки.

Отобранные единицы расфасовки осматривают. Отмечают наличие и состояние бумажной этикетки или литографического оттиска, также дефекты тары: нарушение герметичности, потёки, вздутие крышек и донышек, хлопающие крышки и др. Обязательно указывают на деформацию корпуса и донышек жестяных банок, ржавые пятна, степень их распространения, дефекты продольного и закаточного швов. Результаты наблюдения протоколируют.

Для проверки герметичности тары банки укладывают в сосуд
нагретой до кипения водой (но не ниже 80 °С) на 5 мин при высоте
слоя воды над банками не менее 5 см. Над поверхностью разгерметизированных банок появляются пузырьки воздуха.

 

2. Метод определения доброкачественности консервов

 (термостатная выдержка)

Термостатная выдержка - эффективный способ контроля доброкачественности консервов. Перед микробиологическим анализом консервы выдерживают в термостате до 5-7 сут при температуре 37 °С. Рыбные консервы в масле (шпроты, треска, корюшка и др.) не подлежат термостатной выдержке вследствие возможной активизации стафилококков, которые иногда сохраняются при термической обработке из-за низкой теплопроводности масла. Известно, что развитие стафилококков не сопровождается газообразованием, поэтому банки выглядят не вздутыми.

Не подвергают термостатной выдержке фруктовые компоты, пюре
и соки, томатные и соевые соусы, цельноконсервированные томаты, огурцы и другие консервы, имеющие кислую реакцию, так как кислая среда препятствует токсинообразованию микроорганизмов - возбу­дителей пищевых отравлений (С. botulinum, Staphylococcus spp).

Термостатному контролю не подлежат пресервы, т.е. заведомо несте­рильные продукты, например, кильки, маринованные грибы, овощи ифрукты, сгущённое молоко с сахаром, варенье, джемы, повидло и др.

Консервы вскрывают после нахождения в термостате (бомбажные банки подобной подготовке не подвергают). Непосредственно перед вскрытием консервируемый продукт перемешивают десятикратным переворачиванием с донышка на крышку.

Перед вскрытием банки тщательно протирают спиртом. Затем берут один из заранее приготовленных стерильных ватных тампонов, смачива­ют его спиртом, поджигают в пламени горелки и помещают на крышку банки. Сквозь пламя или под горящий тампон подводят предварительно обожжённый пробойник и прокалывают крышку. Отверстие должно быть около 1-1,5 см в диаметре. Если консервы не содержат жидкой фазы, то делают подряд три-четыре прокола так, чтобы длина отверстия была не менее 3 см.

Лабораторный контроль консервов, выпущенных для реализации и хранения на складах, проводят:

· когда внешний вид партии вызывает подозрения (повышенное количество бомбажных, деформированных, разгерметизирован­ных банок и др.);

· по прямым эпидемиологическим показаниям (пищевые отрав­ления данными консервами);

· в ряде других случаев.

Консервы исследуют на промышленную стерильность, для выяв­ления возбудителей порчи и патогенной (токсигенной) флоры.

 

3. Методы санитарно-микробиологического исследования консервов

3.1. Определение МАМ и ФАнМ

Для выявления МАМ и ФАнМ в две пробирки (по 5 см³) мясопептонного бульона с глюкозой вносят стерильной трубкой по 1 см³ пробы консервированного продукта. Посевы выдерживают при температуре 37 °С в течение 5 сут. Посевы для выявления термофильных микроор­ганизмов инкубируют при температуре 55-62 °С. За признаками роста наблюдают ежедневно. При появлении помутнения, образовании плёнки, выделении пузырьков газа содержимое пробирок микроскопируют и делают пересев в случае необходимости.

Мезофильные бациллы из группы В. subtilis (В. subtilis, В. pumilus, В. licheniformis) в посевах не выделяют газа, имеют форму палочек со спорами, положительно или вариабельно окрашиваются по Граму и синтезируют каталазу. Факультативно-анаэробные газообразующие бациллы из группы В. polymyxa (В. polymyxa, В. macerans, В. circulans) могут не синтезировать каталазу.

При отрицательных результатах тестов на МАМ и ФАнМ в посевах делают вывод об отсутствии активно развивающихся микроорганизмов этой группы.

Обнаружение в посевах признаков роста микроорганизмов, отличных
от таковых у бактерий группы В. subtilis, указывает на присутствие другой
микрофлоры. В таком случае отмечают характер роста на питательной среде, морфологию клеток (кокки, грамотрицательные палочки, грамположительные неспорообразующие палочки), отношение к каталазе.

 

3.2. Методы выявления мезофильных анаэробных микроорганизмов

Для обнаружения мезофильных анаэробных микроорганизмов проводят посев по 2 см³ консервированного продукта в две пробир­ки, содержащие 12 см³ регенерированной среды Китт-Тароцци. Если среда не содержит агар, сразу после посева наслаивают на поверхность голодный агар или вазелиновое стерильное масло в таком количестве чтобы образовался слой высотой 1 см. Посевы держат в термостате при температуре 37 °С в течение 5 сут.

Развитие мезофильных анаэробных микроорганизмов в посевах сопровождается помутнением среды, выделением газа, появлением постороннего запаха, в некоторых случаях разложением кусочков мяса или печени. Материал для приготовления препаратов для микроскопии берут пастеровской пипеткой со дна пробирки.

В мазках с облигатно-анаэробными бактериями видны палочки, окрашивающиеся положительно по Граму и образующие споры. Если, каталаза не выявлена, то анализ прекращают и считают, что в посевах присутствуют мезофильные анаэробы.

Если при микроскопии спорообразующие микроорганизмы не обна­ружены, то отрицательная проба на каталазу не считается достаточной для прекращения исследования. В случае выявления смешанной мик­рофлоры и наличия положительной пробы на каталазу исследование продолжают. Посевы в чашках (1-2 капли) заливают растопленным и охлаждённым до температуры 45 °С МПА с глюкозой и среду тщательно перемешивают. На застывшую поверхность агара накладывают стериль­ное предметное стекло так, чтобы под стеклом не было пузырьков возду­ха. Чашку помещают в термостат при температуре 37 °С на 24-48 ч. При обнаружении под стеклом роста бактерий или разрывов в агаре считают, что в посеве присутствуют мезофильные анаэробные микроорганизмы.

Посевы в чашках можно заливать средой Вильсона-Блер, расплав­ленной и охлаждённой до 45 °С. Посевной материал и среду переме­шивают. Застывшую поверхность заливают холодным агаром. Посевы помещают в термостат на 24-48 ч (температура 37 °С). Появление в агаре чёрных или коричневых колоний свидетельствует о присутствии на посевах гнилостных и протеолитических микробов.

Для подтверждения присутствия бацилл в споровой форме навески консервированного продукта дополнительно вносят в две пробирки со средами, одну из которых прогревают на водяной бане в течение 30 мин при температуре 80±1 °С (для выявления спор мезофильных микроорга­низмов), другую - при температуре 95±1 °С (для термофильных видов).

 

3.3. Метод определения Bacillus cereus

Для проведения испытания отбирают объем 0,1-0,2 см³ подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости. Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей на поверхность питательной среды. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают поверхностным методом параллельно в две чашки Петри с предварительно подсушенной селективной средой (агар желточный с маннитом, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и феноловым красным или лецитин-агар для выделения В. cereus из консервированных продуктов). Посевы на чашках Петри термостатируют при (30±1) °С в течение 24-48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и выбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для В. cereus. На лецитин-агаре колонии диаметром 1,5-2,0 мм, окруженные зонами преципитата синего цвета диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые; затем края колоний становятся изрезанными. На желточном агаре с маннитом – колонии розовые (вследствие отсутствия способности ферментировать маннит), крупные, шероховатые, сухие, окруженные зоной бело-розового преципитата.

Для подтверждения принадлежности подсчитанных колоний к колониям, образуемым В. cereus, микроорганизмы из пяти колоний пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и термостатируют 18-24 ч при (30±1) °С. На скошенном мясо-пептонном агаре В. cereus образует сплошной налет белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью. Со скошенного мясо-пептонного агара готовят препараты, окрашивают по Граму, а также определяют подвижность клеток при микроскопировании методом висячей капли.
В мазках, приготовленных со скошенного агара, В. cereus имеет вид крупных грамположительных палочек размером 1,0-1,2x3,0-5,0 мкм со слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже отдельно друг от друга. В. cereus образует субтерминальные или центральные споры. В висячей капле клетки подвижны, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной подвижностью.

Для полного подтверждения проводят биохимические тесты (способность образовывать ацетилметилкарбинол, ферментировать в анаэробных условиях глюкозу и не ферментировать маннит). Результаты испытания продукта оценивают по каждой пробе отдельно.

 

3.4. Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum

3.4.1. Подготовка продукта к испытанию

Для выявления ботулинических токсинов отбирают 100 см³/г жидкого продукта, культуральной жидкости анаэробных посевов, жидкую фракцию продуктов смешанного состава, водные экстракты или экстракты, приготовленные с физиологическим раствором пастообразных, сыпучих продуктов и продуктов твердой консистенции. Объем приготовленной исходной жидкости должен составлять около 30 см³. Полученные смеси выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 2 ч и затем извлекают из них жидкую фракцию. Жидкую фракцию отделяют от продукта отстаиванием и (или) фильтруют через ватно-марлевый или другой фильтр, не адсорбирующий ботулинические токсины, или центрифугируют при температуре (4±2) °С и частоте вращения 500 с^-1 в течение 1-2 мин. Подготовленную таким образом исходную жидкость переносят в стерильную колбу; хранят при температуре (4±2) °С не более 7 сут.

Для выявления и выделения С. botulinum отбирают 100 см³/г продукта из различных мест, имеющих и не имеющих изменения; гомогенизируют или доводят до однородной консистенции. Допускается для посева использовать продукт, оставшийся после отделения или экстрагирования из него жидкой фазы. Для выявления в любых продуктах вегетативных клеток и спор С. botulinum приготавливают не менее четырех навесок массой 20,0-25,0 г (см³) любого продукта.

3.4.2. Выявление С. botulinum

Для выявления С. botulinum навески продукта вносят на дно сосуда с питательной средой (печеночно-глицериновый агар, Китта-Тароцци). Одну из навесок обрабатывают перед посевом этиловым спиртом (96% или абсолютным). Навеску смешивают с равным объемом спирта в колбе с притертой пробкой и, периодически встряхивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Навеску или осадок навески, обработанные спиртом, вносят в питательную среду. Посевы термостатируют, наблюдая за появлением признаков роста микроорганизмов до 14 сут. После появления признаков роста микроорганизмов посевы продолжают выдерживать в термостате 5 сут. Через 5 сут после появления роста микроорганизмов посевы переносят в холодильник и хранят при (4±2) °С.

Развитие С. botulinum в питательных средах начинается со дна пробирки, с помутнения среды, которое равномерно распространяется по всему столбику жидкости, иногда отступая от поверхности на 0,5-1,0 см, и сопровождается выделением пузырьков газа. Видимое газообразование может отсутствовать. Культуральная жидкость издает посторонний запах: гнилостный, сырный, масляно-кислый - от слабо выраженного до явного. С возрастом клетки С.botulinum частично лизируются, часто оседают на дно, и помутнение среды исчезает.

Непосредственно после появления признаков роста микроорганизмов и затем на 3-и и 5-е сут из посевов отбирают пастеровской пипеткой со дна культуральную жидкость для окраски по Граму, окраски спор, фазово-контрастного микроскопирования и пробы на каталаз. В препаратах устанавливают морфологию бактерий, отмечают наличие типичных клостридиальных клеток, наличие и относительную интенсивность спорообразования и место локализации спор внутри клеток. За 18-24 ч культура С. botulinum образует грамположительные палочки с закругленными концами различной длины и ширины. При старении культуры в ней появляются клетки, не окрашивающиеся по Граму, и спорообразующие клетки обычно в виде ракеток и отдельные споры. Возбудители ботулизма в чистой культуре каталазу не образуют.

После появления признаков роста микроорганизмов пятидневную культуральную жидкость из всех посевов одновременно или последовательно исследуют на присутствие ботулинических токсинов и ботулинических протоксинов.

3.4.3. Выявление ботулинических токсинов

Выявление ботулинических токсинов проводят только по обнаружению ботулинического токсина и определению титра токсина в исходной жидкости или одновременно с использованием противоботулинических антитоксических сывороток. В первом случае для выявления ботулинических токсинов используют исходную жидкость. В две пробирки пипеткой с резиновой грушей переносят по 2-3 см³, а в третью - 2,7 см³исходной жидкости. В последнюю пробирку стерильной пипеткой добавляют 0,3 см³ раствора трипсина или панкреатина. В смеси исходной жидкости с ферментом с помощью раствора гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты устанавливают рН (6,0±1). Затем пробирку со смесью термостатируют при (37±1) °С в течение 1 ч, но не дольше, периодически перемешивая содержимое. Культуральную жидкость, полученную из посевов продуктов в питательную среду, содержащую трипсин или панкреатин, протеолитическим ферментом не обрабатывают. Вторую пробирку с исходной жидкостью кипятят на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Первую пробирку с исходной жидкостью оставляют без обработки.

Непосредственно после окончания обработки исходной жидкости протеолитическим ферментом ставят биологическую пробу на белых мышах. По 0,5-1,0 см³ подготовленной соответствующим образом исходной жидкости вводят в зависимости от условий опыта внутрибрюшинно не менее чем двум белым мышам. Животных осматривают через 1, 2, 4, 12 ч и далее не менее двух раз в день в течение 72 ч. Ботулинические токсины не вызывают молниеносной гибели животных; клинические симптомы ботулинической интоксикации животных токсином типа Е, как правило, появляются через 2-4 ч, токсином других типов - через 10-12 ч после инъекции. Высокие концентрации токсина могут вызвать гибель мышей в течение 1-2 ч без проявления клиники ботулизма. В этом случае ставят повторно биологическую пробу с исходной жидкостью, разведенной в 10-100 раз. Мыши болеют и погибают не раньше, чем через 2 ч после инъекции токсина, чаще всего в течение 4-6 ч. Клинические симптомы болезни и гибели мышей при ботулинической интоксикации очень характерны: шерсть взъерошивается, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают, давая симптом «осиная талия»; появляются судороги, паралич задних конечностей; гибель при явлениях полного паралича из-за остановки дыхания.

При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те животные, которым введена необработанная протеолитическим ферментом жидкость, и, если фермент не инактивировал ботулинический токсин, то болеют и погибают животные, которым введена жидкость, обработанная протеолитическим ферментом. При наличии в исходной жидкости ботулинических протоксинов болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации в первую очередь те животные, которым введена обработанная ферментом жидкость; мыши, которым введена не обработанная ферментом жидкость, могут переболеть, но не погибают или погибают позже.

3.4.4. Серологическое типирование токсина С. botulinum

 (защитный тест)

Присутствие ботулинического токсина в исходной жидкости обнаруживают путем постановки биологической пробы на мышах, защищенных иммунизацией противоботулиническими антитоксическими сыворотками типов А, В, Е (и, если представляется возможным, типов С, D, F, G). Сыворотка типа С должна содержать антитоксины типов С₁ и С₂. Поливалентные сыворотки и типы поливалентных сывороток для опыта подбирают в зависимости от вида анализируемого продукта и предполагаемого типа ботулинического токсина в соответствии с определенными комбинациями и порядком.

При постановке защитного теста для типирования ботулинических токсинов каждому животному внутрибрюшинно вводят по 0,5 см³ моновалентной, двух-, трех- или поливалентной сыворотки. Для инъекции одного типа сыворотки или их смеси каждой группе животных применяют отдельный шприц. Через 60 мин после введения сывороток животным вводят исходную жидкость. Введение животным исходной жидкости начинают с наибольшего ее разведения, используя один шприц для группы мышей, получивших моновалентную сыворотку одного типа или двух-, трех- или поливалентную сыворотку, состоящую из одной комбинации моновалентных сывороток.

При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те мыши, которым введена сыворотка, не гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости. Погибают также мыши, которые получили гомологичную сыворотку в объеме, недостаточном для защиты от высокой дозы токсина. Мыши, получившие сыворотку, в состав которой входит моновалентная сыворотка, гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости, остаются живы. Если болеют и погибают все животные, то биологическую пробу повторяют, применяя более разбавленную исходную жидкость или ранее не использованные комбинации моновалентных сывороток.

Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина реакцией нейтрализации.

 

3.5. Метод определения Clostridium perfringens

Для проведения испытания отбирают объем (1±0,1) см³ подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают глубинным методом параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают сахарным кровяным агаром по Цейсслеру или агаром Вильсон-Блера. Содержимое чашек Петри быстро, осторожными круговыми движениями перемешивают. После застывания среды чашки подсушивают и заливают той же средой так, чтобы высота второго слоя питательной среды была не менее 4 мм. Посевы на чашках Петри термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч в анаэростатах или в анаэробных условиях. После окончания термостатирования отбирают те чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Подсчитывают количество выросших характерных колоний. Характеристика колоний С. perfringens на селективных питательных средах приведена в приложении. Далее проводят изучение морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для С. perfringens.

 

Контрольные вопросы

Какие основные группы консервов вы знаете?

Что такое полуконсервы и пресервы?

Как проводится отбор проб консервов?

Как устанавливается однородность партии консервов?

Как формируют среднюю пробу?

Как проверяют герметичность консервной тары?

Как определяют доброкачественность консервов?

Какие консервированные продукты не подвергают термостатной выдержке и почему?

В каких случаях проводится лабораторный контроль консервов, выпущенных для реализации и хранения на складах?

По каким микробиологическим показателям оцениваются консервы?

Как определяются МАМ и ФАнМ в консервах?

Какие существуют методы выявления мезофильных анаэробных микроорганизмов?

В чем сущность метода определения Bacillus cereus?

Как осуществляется подготовка продуктов при выявлении ботулотоксинов?

Какие среды используют для выявления Cl. botulinum?

Как выявляются ботулинические токсины в консервах?

Как проводится защитный тест при типировании ботулотоксинов?

Как определяется Cl. perfringens в консервах?

Как проводится микробиолоический контроль консервов в зависимости от их групповой принадлежности?

Что такое бомбаж консервных банок, какие причины его возникновения вы знаете?

Какие пищевые продукты чаще всего могут являться причиной возникновения ботулизма?

Какие характерные свойства ботулотоксина вы знаете?

ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ №8

1. Основные технологические категории и группы консервов

Консервы (от лат. conserve - сохранять) - пищевые продукты, приготов­ленные из предварительно обработанного животного или растительного сырья, помещённые в жестяную или стеклянную тару и подвергнутые сте­рилизации в целях предохранения их от порчи при длительном хранении.

Консервы подразделяют на три основные группы:

· собственно консервы (полные консервы);

· полуконсервы;

· пресервы.

К первой группе относят консервы, микробиологическая стабиль­ность которых не зависит от продолжительности хранения при темпе­ратуре, рекомендованной для данного вида продукции. В этом случае стерилизацию осуществляют автоклавированием, гарантирующим полное освобождение от микрофлоры.

Полуконсервы- это пищевые продукты в герметичной таре, под­вергнутые тепловой обработке, которая обеспечивает:

· гибель нетермостойкой неспорообразующей микрофлоры;

· снижение количества спорообразующих микроорганизмов;

· микробиологическую стабильность и безопасность продукта в тече­ние ограниченного срока годности при температуре 6 °С и ниже.

Мясные, ветчинные полуконсервы, шпик, сосиски стерилизуют при температуре 100-110 °С. Содержание при температуре 2-15 °С гарантирует их сохранность и безопасность.

Продукты, законсервированные без применения термической сте­рилизации, называют пресервами (от франц. preserver - предохра­нять). Их можно хранить лишь короткое время и только при темпера­туре 0-5 °С.

 

2. Классификация консервов по группам на основании порядка

санитарно-гигиенического контроля

При распределении по группам принимают во внимание величину рН консервируемого продукта, рецептуру консервов, режим термической обработки и условия реа­лизации в торговой сети.

Выделяют следующие группы консервов:

· группа А - консервированные пищевые продукты, имеющие рН 4,2 ибольше, а также овощные, мясные, мясорастительные, рыбно-растительные и рыбные консервированные продукты с нерегулируемой кислотнос­тью, приготовленные без добавления кислоты; компоты, соки и пюре из абрикосов, персиков и груш с рН 3,8 и больше; сгущённые стерилизованные молочные консервы; консервы со сложным сырьевым составом (плодово ягодные, плодово-овощные и овощные с молочным компонентом);

· группа Б- консервированные продукты, содержащие томаты:

- неконцентрированные продукты (цельноконсервированные тома­ты, томатные напитки) с содержанием сухих веществ менее 12%;

- концентрированные продукты, с содержанием сухих веществ 12% и более (томатная паста, томатные соусы, кетчупы и др.);

· группа В- консервированные слабокислые овощные маринады, соки, салаты, винегреты и другие продукты с рН 3,7-4,2, в том числе огурцы консервированные, овощные и другие консервы с регулируе­мой кислотностью;

· группа Г- консервы овощные, фруктовые и плодово-ягодные пастеризованные с рН меньше 3,7; консервы для общественного питания с сорбиновой кислотой и рН 4,0 и меньше; консервы из абрикосов, персиков и груш с рН меньше 3,8; овощные, фруктовые (из цитрусовых) плодово-ягодные, в том числе с сахаром, натуральные с мякотью, кон­центрированные, пастеризованные соки с рН меньше 3,7; соки консервированные из абрикосов, персиков и груш с рН 3,8 и меньше; напитки иих концентраты на растительной основе с рН 3,8 и меньше, фасованные методом асептического розлива;

· группа Д- пастеризованные мясные, мясорастительные, рыбные и рыбно-растительные консервированные продукты (шпик, солёный и копчёный бекон, сосиски, ветчина и др.);

· группа Е- пастеризованные газированные фруктовые соки игазированные фруктовые напитки с рН 3,7 и меньше.

Консервированные продукты групп А, Б, В, Г и Е относят к пол­ным консервам, а группы Д - к полуконсервам.

 

3. Микробиологический контроль консервов в зависимости

от их групповой принадлежности

При отсутствии требований к микробиологическим показателям, в зависимости от принадлежности консервов к определенной группе, в них выявляют следующие микроорганизмы:    

· В низкокислотных консервах (группы А), предназначенных к реализации при температуре ниже 40 °С, выявляют жизнеспособные мезофильные аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные микроорганизмы.

· В низкокислотных консервах (группы А), которые могут при реализации подвергаться воздействию температуры 40 °С и выше, дополнительно выявляют термофильные аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные микроорганизмы, выделяя среди них кислотообразующие бациллы.

· В консервах групп Б и В выявляют мезофильные анаэробные микроорганизмы, плесневые грибы, дрожжи и молочнокислые микроорганизмы.

· В консервах группы Г выявляют плесневые грибы, дрожжи и молочнокислые микроорганизмы.

· В концентрированных плодово-ягодных консервах группы Г (соках концентрированных, варенье, джеме, повидле, конфитюре и др.) выявляют плесневые грибы и дрожжи.

· В пастеризованных газированных фруктовых соках и напитках (группы Е) определяют количество:

- мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов;

- бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий);

- плесневых грибов, а также дрожжи и молочнокислые микроорганизмы.

 

4. Критерием безопасности (промышленной стерильности) консер­вированных пищевых продуктов служит отсутствие:   

· микроорганизмов, способных развиваться при температуре хранения, установленной для конкретного вида консервов;

· микроорганизмов и микробных токсинов, опасных для здоровья человека (см. Приложение 8 к СанПиН 2.3.2.1078-01).

В части банок после проведения стерилизации может сохраняться, небольшое количество так называемой остаточной микрофлоры. В таких консервах обнаруживают, главным образом, спорообразующие формы микробов. Среди них чаще всего встречаются как аэробные микро­организмы - В. subtilis, В. mesentericus, так и анаэробные - С. sporogenes,С putrificus и др. Значительную долю остаточной микрофлоры консервов составляют термофильные микробы. Некоторые из них в процессе своей жизнедеятельности образуют газообразные продукты и вызывают порчу консервов, сопровождающуюся вздутием банок. Другие не дают газооб­разования и вызывают так называемую плоскокислую порчу.

Высокая температура в значительной степени ослабляет остаточную микрофлору, однако, последняя может возобновить жизнедеятельность через некоторое время, особенно при неправильном хранении консервов. Поэтому в доброкачественных, правильно простерилизованных консервах должны отсутствовать микроорганизмы, вызывающие инфекцион­ные заболевания или представляющие опасность для здоровья человека. Определение патогенных микроорганизмов проводят в случаях возник­новения пищевых отравлений либо при сомнении в качестве продукции и необходимости решения вопроса о возможности её реализации.

В банках с сохранившимися жизнеспособными микроорганизма­ми при неправильном хранении происходит их размножение и порча консервов, выявляемая наружным осмотром. Возникает так называе­мый бомбаж - вздутие банок. Следует различать бомбаж биологичес­кого, химического и физического происхождения.

1.Биологический бомбажвызывают газы, образующиеся в результате размножения микроорганизмов. В результате их жизнедеятельности разлагаются белки, жиры и углеводы с образованием газов (H₂S, NH₃, С0₂), которые давят на стенки и донышки банки и вызывают её взду­тие. Биологический бомбаж чаще всего вызывают спорообразующие анаэробы и некоторые термофильные бактерии. Иногда в этом процессе принимают участие факультативные анаэробы Е. coli, P. vulgaris и др. Бомбаж фруктовых и молочных консервов нередко бывает обусловлен дрожжами. Биологический бомбаж с санитарно-гигиенической точки зрения наиболее опасен. Консервы с биологическим бомбажем непри­годны в пищу и подлежат обязательному уничтожению, независимо от вида микроорганизма.

2.Химический,или водородный бомбаж,возникает в результате сильной коррозии металла под влиянием кислого содержимого банки. При взаимодействии кислоты с металлом выделяется молекулярный водород. Давление последнего приводит к изменению внешней формы банок. Для предотвращения химического бомбажа продукты с повы­шенной кислотностью укладывают в жестяные банки, покрытые с внутренней поверхности специальным кислотоупорным лаком. Консервы с химическим бомбажем практически безвредны, но они не подлежат реализации в торговой сети, поскольку невозможно на складе достоверно дифференцировать этот вид бомбажа от бомбажа биологического происхождения.

 3. Физический бомбаж либо является результатом переполнения банки консервированным продуктом, либо обусловлен подмораживанием консервов и расширением содержимого банок вследствие образования в них льда. Физический бомбаж бывает и при вполне доброкачественных консервах, однако, реализация их требует осторожности. При подмораживании бомбаж обычно массовый, но выявить в таких партиях консервов отдельные банки, вздутие которых произошло под влиянием опасных микроорганизмов, невозможно. Поэтому консервы с физическим бомбажем вследствие замораживания можно использовать только после предварительной варки.

Различают также так называемые хлопуши - вздутие доныше (крышек) консервной банки.

Кроме порчи консервов, происходящей в результате развития
остаточной микрофлоры, порча может быть и результатом попадания
микробов из окружающей среды в случае нарушения герметичности банки. Таким образом, отсутствие бомбажа ещё не свидетельствует о стерильности консервов, в то же время наличие отдельных бомбажных банок в партии не доказывает недоброкачественности всей партии.

 

4.Характеристика колоний С. perfringens на селективных питательных средах

Название питательной среды	Характеристика колоний
1. Агар триптозо-сульфит-циклосериновый или агар сульфит-полимиксин-неомициновый, или Вильсон-Блера	Колонии черного цвета различной интенсивности окраски, имеющие форму двояковыпуклой линзы, комочка ваты или "самолетика"
2. Сахарный кровяной агар по Цейсслеру с антибиотиками	Колонии зеленеющие на воздухе окружены одной или двумя зонами гемолиза.
	Одна полупрозрачная зона гемолиза обусловлена действием лецитиназы.
	При образовании двух зон гемолиза внутренняя прозрачная зона обусловлена действием гемолизинов, а наружная - действием лецитиназы

З А Н Я Т И Е 9

Дата ______________

 

Тема: Санитарно-микробиологическое исследование молока

И молочных продуктов.

 

План занятия:

1. Разбор основных правил отбора и подготовки проб молока и молочных продуктов к анализу.

2. Метод определения уровня бактериальной обсемененности сырого молока - редуктазная проба.

3. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов КМАФАнМ.

4. Метод определения БГКП по признакам роста на жидкой среде Кесслер.

5. Микроскопический метод исследований микрофлоры молока и молочных продуктов.

6. Методы определения Staphylococcus aureus.

6.1. Метод определения количества Staphylococcus aureus

с предварительным обогащением.

6.2. Метод определения количества Staphylococcus aureus

без предварительного обогащения.

7. Метод определения дрожжей и плесневых грибов.

Методические указания

1. Разбор основных правил отбора и подготовки проб молока

 и молочных продуктов к анализу

 

Пробы для микробиологических анализов молока и молочных продуктов отбирают до взятия образцов для изучения физико-химических и органолептических признаков. Пробы жидких и полужидких продуктов отбирают после тщательного перемешивания стерильным черпаком и переносят около 50-60 см³ в стерильную посуду. От молока, расфасованного в бутылки, пакеты, кисломолочных продуктов отбирают по 2 образца (количество образцов в выборке может достигать 4-5 в зависимости от величины партии). Пробы сливочного масла, творога, сыра отбирают с помощью профламбированного щупа из разных мест тары. Поверхность сыра в том месте, где будет взята проба, прижигают раскалённым ножом или шпателем. Отобранные точечные пробы переносят в посуду и тщательно перемешивают, составляя объединённую пробу, предназначенную для анализа: молоко - 1 л; масло, сыры - в среднем 100-150 г. Молочные консервы отбирают по 2 банки от партии. Сухое молоко, сухие сливки отбирают из разных мест с помощью стерильной ложки - всего около 200 г продукта.

Все отобранные пробы помещают в стерильные банки или бутыл­ки с хорошо закрывающимися крышками. Пробы пломбируют или опечатывают и немедленно отсылают в лабораторию. Разрешённое время транспортировки скоропортящихся продуктов до начала иссле­дования (при температуре не выше 6 °С) составляет не более 4 ч.

При подготовке проб к исследованию молоко и сливки тщательно перемешивают. Из твёрдых продук­тов (сыр, творог) готовят навеску 10 г. Затем продукт тщательно растирают и изготавливают 10% взвесь в 0,9% растворе натрия хлорида (90 см³). Масло и мороженое предварительно растапливают на водя­ной бане при температуре 30±2 °С. Для приготовления разведений используют нижний слой получившейся суспензии.

 

2. Метод определения уровня бактериальной обсемененности

сырого молока - редуктазная проба

 

В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.

Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсеменённость сырого молока.

Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения.

В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого сырого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37±1) °С. При отсутствии редуктазника допускается использовать водяную баню, обеспечивающую поддержание температуры (37±1) °С. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с сырым молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше, температуру (37±1) °С поддерживают в течение всего времени определения. Пробирки с сырым молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой). Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 1 ч. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из классов в соответствии с таблицей 1. Цветовая шкала для определения класса сырого молока по редуктазной пробе с резазурином представлена в приложении к занятию.

Таблица 1.Оценка редуктазной пробы

Класс	Продолжительность изменения цвета	Окраска молока	Ориентировочное количество бактерий в 1 см3 молока
I	Через 1 ч	От серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком	До 500 тыс.
II	Через 1 ч	Сиреневая с розовым оттенком или ярко-розовая	От 500 тыс. до 4 млн
Примечания 1. Для оценки качества сырого молока при бактериальной обсемененности до 100 тыс. в 1 см3 используют посев на чашки Петри на среду КМАФАнМ.   2. При бактериальной обсемененности сырого молока до 300 тыс. время выдержки проб составляет 1,5 ч. Окраска сырого молока - от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком.   3. Цвет сырого молока от бледно-розового до белого через 1 ч выдержки свидетельствует о бактериальной обсеменности свыше 4 млн жизнеспособных клеток.

 

3. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

 

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2.Стандартные разведения молочных продуктов для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэроб­ных микроорганизмов

Наименование продукта	Засеваемый объём или масса, см3 или г
Молоко и сливки сырные	0,0001	0,00001	0,000001
Масло сладко-сливочное	0,01	0,001	0,0001
Молоко и сливки пастеризованные	0,1	0,01	0,001
Молоко или сливки сгущённые с сахаром, какао и кофе со сгу­щённым молоком и сахаром	0,1	0,01	0,001
Мороженое	0,1	0,01
Сыр плавленый	0,1	0,01	0,001

 

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает от 15 до 300 колоний.

Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см³ в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14±1) см³ расплавленной и охлажденной до температуры 40 °С - 45 °С питательной средой для определения КМАФАнМ. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и тоже же разведения в количестве 1,0 и 0,1 см³. Сразу после заливки среды содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. Допускается проведение двух параллельных определений, то есть проведение посева каждого разведения на две чашки Петри. После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат при температуре (30±1) °С на 72 ч.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки. При подсчете колоний рекомендуется использовать счетчики.

При большом количестве колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают количество колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднеарифметическое значение количества колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом, находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 см³ или 1 г продукта каждой чашке Петри вычисляют по формуле:

X=n ×10^m,

где n - количество сосчитанных колоний; m - число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое, полученное по всем чашкам.

 

4. Метод определения БГКП по признакам роста

на жидкой среде Кесслер

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу с образованием газа и кислоты при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. Признак роста БГКП на жидкой среде Кесслер - визуально наблюдаемое накопление газа в поплавке.

Посев продуктов или их разведений в жидкую среду Кесслер проводят в количествах, указанных в таблице 3.

 

Таблица 3.Количество продукта при посеве в среду Кесслер для выделения бактерий группы кишечной палочки

Наименование продукта	Засеваемый объем или масса продукта, см3, г
Молоко и сливки сырые	0,1-0,00001
Молоко и сливки пастеризованные, кисломо­лочные продукты	1; 0,1; 0,01
Масло	1; 0,1; 0,01
Мороженое	0,1
Сыр	0,1-0,001
Творог и сметана	0,1-0,001
Молоко или сливки, сгущённые с сахаром, какао и кофе со сгущённым молоком и сахаром	0,1
Молоко сухое, сливки сухие	0,1

По 1 см³ соответствующих разведений продукта засевают в пробирку с 5 см³ жидкой среды Кесслер. Каждое разведение засевается в одну пробирку со средой.

Посев 10 см³ пастеризованного молока, отобранного после пастеризатора, 10 см³ закваски на чистых культурах, 3 см³ кефирной закваски, 10 см³ замороженного бактериального концентрата или 10 см³ разведения 1:10 сгущенных молочных продуктов с сахаром проводят в колбы с 40-50 см³ жидкой среды Кесслер.

Пробирки или колбы с посевами помещают в термостат при (37±1) °С на 18-24 ч. Окончательный результат снимают через 24 ч для всех продуктов, кроме мороженого. Для мороженого продолжительность культивирования посевов - 48 ч.

При снятии результатов пробирки или колбы с посевами просматривают и визуально определяют наличие или отсутствие газа в поплавках. При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в данном объеме продукта. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии БГКП в нем.

 

5. Микроскопический метод исследований микрофлоры молока

 и молочных продуктов

 

В молочной промышленности микроскопические исследования проводят при изучении микроморфологических особенностей микрофлоры молока, лабораторных и производственных заквасок, продуктов переработки молока.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода - не менее 10⁵ клеток в 1 см³ или 1 г исследуемого продукта.

Для приготовления препарата жидкого продукта на чистое предметное стекло наносят петлей каплю продукта и распределяют на площади 1-2 см².

Для приготовления препарата из творога, творожных продуктов, творожных сырков, сырных и альбуминных паст на стекло наносят каплю воды, вводят в нее петлей исследуемый материал, тщательно перемешивают и растирают на площади 1-2 см².

Для приготовления препарата из твердых продуктов - сыр, сырные продукты и т.д. их тщательно растирают со стерильной водой в стерильной ступке. Затем полученную массу петлей наносят на чистое предметное стекло и распределяют на площади 1-2 см².

При исследовании колоний микроорганизмов, выросших на твердых питательных средах (агаровая культура), часть колонии отбирают с помощью бактериологической петли или иглы и тщательно растирают в капле воды на предметном стекле.

Приготовленные микропрепараты высушивают при комнатной температуре на воздухе. Мазки фикси­руют и окрашивают 10% метиленовым раствором или по Граму. Кисломолочные продукты имеют свою специфическую микрофлору (табл. 4).

Таблица 4. Характеристика микрофлоры кисломолочных продуктов

Наименование продуктов	Ориентировочный состав микрофлоры	Характеристика микропрепарата
Творог, творожные продукты, сметана	Лактококки или лактококки и термофильные молочнокислые стрептококки	Кокки, диплококки, короткие цепочки кокков
Простокваша	Лактококки и (или) термофильные молочнокислые стрептококки	Кокки, диплококки, короткие цепочки кокков
Ряженка	Термофильные молочнокислые стрептококки или термофильные молочнокислые стрептококки и болгарская палочка	Кокки, диплококки, длинные цепочки кокков или кокки, диплококки, длинные цепочки кокков и крупные палочки одиночные, в парах, цепочках
Ацидофилин	Ацидофильная молочнокислая палочка, лактококки и дрожжи	Крупные палочки одиночные и в парах, короткие цепочки палочек, кокки, диплококки, короткие цепочки кокков, возможно наличие дрожжей
Биойогурт, биоряженка	Термофильные молочнокислые стрептококки, болгарская палочка, бифидобактерии	Кокки, диплококки, крупные и тонкие палочки
Актифилин, биосметана	Лактококки, бифидобактерии, L. casei	Кокки, диплококки, цепочки кокков, тонкие палочки
Бифитон	Лактококки, пропионовокислые бактерии, бифидобактерии	Кокки, диплококки, тонкие палочки

 

6. Методы определения Staphylococcus aureus

6.1. Метод определения количества Staphylococcus aureus

с предварительным обогащением

Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений.Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см³ в пробирки или колбочки с солевым бульоном. Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10. Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар. Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.

После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний. На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды. На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых. На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1-3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Посевы выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч.

У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus колоний, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

Далее ставят реакцию плазмокоагуляции.

В пробирку с 0,5 см³ разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37±1) °С в течение 3-6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

 

 

Реакцию считают положительной, если:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом. При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

 

6.2. Метод определения количества Staphylococcus aureus

без предварительного обогащения

 

1 см³ жидкого продукта или его разведения наносят на поверхность питательных сред Байрд-Паркера, желточно-солевой агар и молочно-солевой агар в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри. С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти - все колонии характерные для Staphylococcus aureus и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Если при изучении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к Staphylococcus aureus. В остальных случаях количество Staphylococcus aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см³ после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле:

 

где Σn₁; Σn₂- количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n - число десятикратных разведений.

 

7. Метод определения дрожжей и плесневых грибов

 

Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта и (или) их разведений в питательные среды, определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток.

Продукт и (или) его разведения высевают параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до температуры (45±1) °С средой (Сабуро, среда агаризованная с левомицетином; среды агаризованные: с окситетрациклином; окситетрациклином и гентамицином; антибиотиками группы пенициллина и стрептомицина; неомицина сульфата). Параллельно с этим заливают чашку А Петри 15-20 см³ среды для проверки ее стерильности.

Посевы термостатируют при температуре (24±1) °С в течение 5 сут, посевы на чашках Петри термостатируют дном вверх. Через 3 сут термостатирования проводят предварительный учет типичных колоний или появления характерных признаков роста на жидких питательных средах.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5 сут проводят окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Развитие дрожжей в жидкой среде сопровождается появлением мути, запаха брожения и газа.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний или из посевов на жидкую среду готовят препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды. Затем в эту каплю прокаленной иглой вносится часть колонии или петлей наносят каплю культуральной жидкости. Полученная суспензия покрывается покровным стеклом.

Результаты микроскопирования оценивают пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в приложении.

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г или в 1 см³ продукта вычисляют по формуле:

где Σ^С- сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях;

n₁ - количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

n₂ - количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

n - степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Контрольные вопросы

В чем заключаются основые правила отбора и подготовки проб молока и молочных продуктов к исследованию?

Что такое редуктазная проба?

Как оценивается редуктазная проба?

Как определяется каличество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в молоке?

На чем основан метод определения БГКП?

Для каких целей проводится микроскопический метод исследования микрофлоры молока молока и молочных продуктов?

Какая микрофлора содержится в кисломолочных продуктах?

На чем основан метод определения золотистого стафилококка с предварительным обогащением?

Какие особенности определения количества золотистого стафилококка без предварительного обогащения?

В чем сущность метода определения дрожжей и плесневых грибов?

Какие бактерии относятся к специфической микрофлоре молока?

Какие существуют фазы микробного обсеменения молока?

Какие бактерии представляют неспецифическую микрофлору молока?

При каких заболеваниях молоко и молочные продукты являются основных факторами передачи возбудителей?

ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ № 9

 

1. Понятия специфическая и неспецифическая микрофлора молока.

Различают специфическую и неспецифическую микрофлору молока и молочных продуктов.

К специфической микрофлоремолока и молочных продуктов отнсят возбудителей молочнокислого, спиртового и пропионовокислого брожения. Процессы, обеспечиваемые жизнедеятельностью этих микроорганизмов, лежат в основе приготовления кисломолочных продуктов (творога, кефира, простокваши, ацидофилина и др.).

Бактерии молочнокислого брожения считаются нормальной микрофлорой молока и молочных продуктов. Главную роль при скисании молока и молочных продуктов играют молочнокислые стрептококки S. lactis, S. cremoris и др. Менее активные виды молочнокислых стретококков (S. citrovorus, S. lactis subsp. diacetylactis) продуцируют летучие кислоты и ароматические вещества и поэтому широко используютспри получении сыров. В группу молочнокислых бактерий также входят молочнокислые палочки: (L. acidophilus, L. casei и др.).Lactobacillus (син.: лактобактерии, лактобациллы) - род бактерий сем. Lactobacillaceae, объединяющий грамположительные неподвижные неспорообразующие анаэробные палоч­ки, разлагающие углеводы с образованием молочной кислоты. Спиртовое брожение молока и молочных продуктов вызвано основном дрожжами (Saccharomyces lactis и др.).

Неспецифическую микрофлорумолока составляют гнилостные бактерии (Proteus), аэробные и анаэробные бациллы (В. subtilis, В. Megatherium, С. putrificum) и многие другие. Эти микроорганизмы разлагают белок молока, участвуют в молочнокислом брожении и придают молоку неприятный вкус и запах. Поражение молочнокислых продуктов плесенью (Mucor, Oidium, Aspergillus и др.) придаёт им вкус прогорклого масла. БГКП, попадая в молоко, вызывают изменение вкуса и запаха молока. Другие виды грамотрицательных бактерий (В. fluorescens, В. Liquifaciensi, P. putrifaciens и др.) обладают различной степенью протеолитической активности и придают молоку и молочнокислым продуктам прогорклый или горький вкус и гнилостный запах.

 

2. Фазы микробного обсеменение молока

 

1.Бактерицидная фаза.Свежевыдоенное молоко, хотя и содержит уже сотни микробов в 1 см³ (главным образом стафилококки и стрептокок­ки), обладает бактерицидными свойствами за счёт присутствия в нём нормальных антител. В связи с этим в течение определённого времени развитие бактерий в молоке задерживается. Этот период называют бак­терицидной фазой. Длительность бактерицидной фазы колеблется в пределах 2-36 ч в зависимости от физиологических особенностей живот­ного (в раннем периоде лактации бактерицидность молока выше).

2.Фаза смешанной микрофлорыдлится около 12 ч. В этот период ещё не преобладают какие-либо группы микроорганизмов, так как обилие питательного субстрата и пространственные возможности позволяют достаточно свободно развиваться многим видам.

3. Фаза молочнокислых стрептококков характеризуется преоблада­нием названной группы микроорганизмов (S. lactis, S. termofilus, S. cremoris и др.), которые интенсивно превращают лактозу в молочную кислоту, изменяя реакцию среды в кислую сторону. Накопление молочной кис­лоты ведёт в дальнейшем к отмиранию молочнокислых стрептококков и смене их более кислотоустойчивыми молочнокислыми бактериями, что наступает через 48 ч, знаменуя начало четвёртой фазы.

4. В фазе молочнокислых палочекгосподствующее положение приобре­тают палочковидные формы молочнокислых бактерий (L. lactis, L. crusei, L. bulgaricum и др.). Постепенно нарастающая кислотность приводит к угне­тению роста и постепенному отмиранию других видов бактерий. К концу четвёртой фазы дальнейшие возможности развития молочнокислой микро-флоры исчерпываются, а на смену приходят грибки, для которых молочная кислота служит питательным субстратом.

5. В фазе грибковой микрофлорыразвиваются плесень и дрожжи жизнедеятельность которых приводит к утрате продуктом свое пищевой ценности. Дрожжи представлены, главным образом, видам из рода Torula, реже обнаруживают некоторые виды сахаромицет. Из плесени встречаются: молочная плесень (Galactomyces geotrichum), покрывающая в виде пушка поверхность простокваши и сметаны, также аспергилловая, пеницилловая и мукоровая. Действие грибковой флоры ведёт к нейтрализации среды, а это делает её вновь пригодной для бактерий. Развиваются гнилостные бактерии, вызывающие протеолиз казеина, затем анаэробные спорообразующие маслянокислые бактерии. Смена микрофлоры прекращается только с наступлением полной минерализации всех органических веществ молока.

3. Характеристика дрожжей и плесневых грибов и цветовая шкала по редуктазной пробе.

Группа микроорганизмов	Характеристика
Дрожжи	Одноклеточные микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, длиной от 2,5 до 30 мкм и шириной от 2,5 до 10 мкм, часто почкующиеся
Плесневые грибы	Состоят из нитей-гифов, без перегородок или септированных на клетки. Гифы образуют боковые выросты и разветвления, от вегетативных гифов поднимаются гифы, несущие плодовые тела

 

I	I	II	II	III	III

 

Рисунок №1. Цветовая шкала для определения класса сырого молока

по редуктазной пробе с резазурином

З А Н Я Т И Е 10

Дата ______________

 

Тема: Санитарно-микробиологическое исследование пива

И безалкогольных напитков.

План занятия:

1. Санитарно-микробиологические исследования пива на производстве.

1.1. Микробиологический контроль пивных дрожжей.

1.2. Микробиологический контроль сусла.

1.3. Микробиологический контроль готового пива.

2. Санитарно-микробиологическое исследование готовой безалкогольной продукции и пива.

2.1. Особенности санитарно-микробиологического исследования бутилированных пива, кваса, безалкогольных напитков и минеральных вод.

2.2. Определение бактерий группы кишечных палочек в пиве и квасе.

2.3. Определение коли-индекса газированных безалкогольных напитков.

2.4. Методика и последовательность проведения санитарно-микробиологического анализа бутылочного и баночного пива.

 

Методические указания

1. Санитарно-микробиологические исследования пива на производстве

1.1. Микробиологический контроль пивных дрожжей

 

Пивные дрожжи - важный объект контроля производственно лаборатории. Непосредственно из аппарата чистых культур или перед подачей в цех их проверяют методом микроскопии на присутствие нежизнеспособных дрожжевых клеток и так называемых диких дрожжей. Наличие дрожжей определяют посевом по 0,1 см³ суспензии из разведения 10^-5 на 3 среды: с кристаллическим фиолетовым, лизином и для контроля на сусло-агар. Посевы инкубируют 48 ч при (30 +/- 1) °C. Результаты учитывают следующим образом: на сусловом агаре растут как пивные, так и все виды диких дрожжей; на среде с кристаллическим фиолетовым растут только дикие дрожжи рода Saccharomyces; на среде с лизином только дикие дрожжи р. р. Candida, Torulopsis, Brettanomyces и др., не относящиеся к роду Saccharomyces. При инкубировании свыше 48 ч на селективных средах начинают расти и пивные дрожжи. В дрожжах количество бактерий не должно превышать 1% от общего числа дрожжевых клеток. Содержание нежизнеспособных дрожжей допускается в пределах 5%, в 70-75% всех дрожжевых клеток должен содержаться гликоген. При повышенном количестве бактерий в дрожжах их обрабатывают 35% раствором персульфата аммония - (NH₄)₂S₂0₈ в течение 30-60 мин.

1.2. Микробиологический контроль сусла

В охлажденном сусле определяют ОМЧ высевом 1 см³ пробы глубинным способом на питательный агар или мясо-пептонный агар. После инкубации при температуре (30 +/- 1) °C в течение 48 ч подсчитывают число выросших колоний. ОМЧ в 1 см³ сусла не должно быть больше 300.

Кислотообразующие бактерии выявляют посевом 1 см³ пробы сусла глубинным способом на сусловый агар с мелом. После инкубации при (30 +/- 1) °C в течение 72 ч кислотообразующие бактерии дают вокруг выросших колоний зоны растворения мела. В охлажденном сусле кислотообразующие бактерии должны отсутствовать.

Сусло из стерилизатора после его охлаждения при разведении чистой культуры дрожжей высевают в объеме 1 см³ глубинным способом на питательный агар или мясо-пептонный агар и сусловый агар. После инкубации в течение 48 ч рост любых форм микроорганизмов должен отсутствовать.

 

1.3. Микробиологический контроль готового пива

Непосредственно перед вскрытием бутылок с пивом их перемешивают 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или круговым движением. После вскрытия горлышко стеклянных бутылок обжигают и отбирают пиво в объеме, необходимом для анализа. Анализ производят не менее чем из двух бутылок. Определяют ОМЧ на питательном агаре или мясо-пептонном агаре, наличие БГКП и стойкость пива в товарной упаковке при (20 +/- 2) °C.

На производстве ОМЧ в 1 см³ пива не должно превышать 500 клеток. БГКП определяются методом посева в среду Кесслер с лактозой при соотношении продукта и среды 1:10. Пиво перед исследованием подщелачивают до рН 7,2-7,4 стерильным 10% раствором бикарбоната натрия. Посевы инкубируют при температуре 37±0,5 °С в течение 24 ч. Для специальных сортов бутылочного пива с массовой долей сухих веществ в начальном сусле 12% и более БГКП не допускаются в 10 см³; для массовых сортов бутылочного пива с массовой долей сухих веществ в начальном сусле 10 - 11% БГКП не допускаются в 3 см³; в пиве разливном БГКП не допускаются в 1 см³. При отсутствии роста дают заключение о соответствии пива нормативу. При наличии признаков роста делают пересев на твёрдые пластинчатые среды (чаще Эндо), дальнейший ход анализа обычный.

Важным исследованием, проводимым производственными лабо­раториями, служит определение стойкости пива в товарной упаковке методом выдерживания его в термостате при температуре 20±2 °С.

 

2. Санитарно-микробиологическое исследование готовой

безалкогольной продукции и пива

2.1. Особенности санитарно-микробиологического исследования бутилированных пива, кваса, безалкогольных напитков и минеральных вод

 

Перед проведением анализа из бутылок удаляют растворённый углекислый газ. С целью дегазации с бутылок снимают кронен-пробки, заменяя их ватно-марлевыми, и помещают термостат на 1 ч при температуре 43 °С. Затем проводят нейтрализацию напитков (пиво, квас) стерильным 10% раствором бикарбоната натрия до слабощелочной среды (рН 7,2-7,4).

Метод мембранной фильтрации

На первом этапе проводят асептическую фильтрацию пробы жидкости через стерильную мембрану. Мембраны для фильтрациис размером пор 0,45 нм используют для определения ОМЧ и БГКП, 0,8 нм - дрожжей и плесени. Далее следует промывка мембраны небольшим объёмом (примерно 20 см³) стерильной дистиллированной воды (в некоторых случаях). Затем переносят мембрану в стерильную чашку Петри на подкладку из стерильного абсорбента, пропитанную стерильной средой. После инкубации чашки Петри при соответствующей температуре подсчитывают количество колоний через соответствующие интервалы времени.

---

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 1584; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

---

Мы поможем в написании ваших работ!