Тема 12. Санитарно-биологические методы исследования почвы
Цель занятия. Изучить особенности методов определения бактериальной обсемененности, санитарно-гельминтологических и энтомологических исследований почвы.
Практические навыки. Приобрести навыки определения общей микробной обсемененности почвы и санитарно-показательных микроорганизмов в ней, освоить методы гельминтологического и энтомологического исследования почвы.
Материалы и оборудование. Пробы почвы, чашки Петри, питательные среды, пробирки, пипетки, стерильные колбы, стеклянные воронки, фильтры, микроскоп, термостат, 5 %-ный раствор гидроксида натрия, раствор нитрата натрия.
Задание. 1. На чашках Петри с посевами исследуемых суспензий почвы в различных разведениях подсчитать число колоний. Провести сравнительный анализ результатов.
2. Провести исследование почвы на наличие яиц и личинок гельминтов, личинок и куколок мух.
3. Дать санитарную оценку степени загрязнения почвы по результатам бактериологического, гельминтологических и энтомологических анализов.
При полном санитарно-бактериологическом анализе исследование почвы включает определение следующих показателей:
Общее число сапрофитных бактерий (микробное число);
Число бактерий группы кишечной палочки;
Количество анаэробов (Cl. perfringens);
Количество термофильных микроорганизмов, определяющих характер загрязнения (навоз, фекалии, сточные жидкости).
Отбор проб для бактериологического исследования. На обследуемой территории, площадью до 1000 м2 определяют два участка по 25 м2 (один из них вблизи источника загрязнения). Для составления среднего образца на каждом участке пробы отбирают в 5 точках по диагонали или в 4 точках по краям и одной в центре (принцип «конверта»). Пробы берут с глубины до 20 см стерильным инструментом (маленькая лопата, совок или шпатель). Образцы из глубоких слоев почвы (0,75–2 м) следует брать буром. При отсутствии бура выкапывают яму необходимой глубины и стерильным совком отбирают пробы с каждого горизонта, начиная с нижнего. Используемые инструменты перед взятием проб необходимо обмывать, обтирать спиртом и обжигать.
|
|
|
С участков полей орошения, огородов почву берут на глубине нахождения в ней клубнеплодов (25 см). Средняя проба составляется из трех отдельно взятых образцов с каждой гряды.
При изучении влияния загрязнения почвы на санитарное состояние подземных вод и открытых водоемов пробы следует брать на глубине 0,75–2 м. На кладбищах и скотомогильниках пробы берут с глубины 25 см и ниже глубины захоронения, а на участках для обеззараживания хозяйственно-бытовых отбросов – с глубины 25, 100 и 150 см.
200–300 г почвы переносят в стерильную банку, закрывают ватной пробкой. Горлышко банки заворачивают бумагой и перевязывают. На банку ставят номер и наклеивают записку, в которой указывают необходимые сведения (дату, место отбора пробы), после чего быстро направляют в лабораторию. В лаборатории из полученной почвы извлекают инородные частицы, крупные комки дробят, просеивают через стерильное сито с диаметром отверстий 3 мм. Затем образец просеянной почвы перемешивают и отбирают 30 г для разведения. Если невозможно провести бактериологическое исследование в день отбора проб, то допускается хранение ее не более 24 часов при температуре 1–2 0С.
|
|
|
Подготовка пробы для анализа. 30 г почвы помещают в стерильную колбу, куда добавляют 270 мл стерильного физиологического раствора. После этого содержимое тщательно взбалтывают в течение 10 минут, отстаивают 2–5 минут, а затем из полученной суспензии делают ряд разведений на стерильном физиологическом растворе, начиная от 1:10 до 1:1 000 000 в зависимости от загрязнения почвы.
Определение общего числа микроорганизмов. Исследуемую суспензию почвы в различных разведениях в объеме 0,1 мл стерильной пипеткой вносят в чашку Петри с питательной средой (Эндо, Плоскирева и др.). Чашки с посевом ставят в термостат при температуре 37+1 0С на 24 часа, после чего выросшие колонии подсчитывают обычным способом и результат выражают на 1 г почвы.
|
|
|
Наличие микробов группы кишечной палочки выявляют посевом почвенной суспензии различных разведений в бродильные сосуды с модифицированной средой Кесслера-Свенартона. Пептон (10 г) и бычью желчь (50 мл) заливают 1 л воды и перемешивают. Полученную смесь кипятят 20–30 минут, фильтруют, добавляют 10 г лактозы. Объем фильтрата доводят водой до 1 л, устанавливают рН среды 7,8–8,2 и добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета. Готовую смесь заливают в пробирки с бродильными трубочками и стерилизуют в автоклаве при 112 0С в течение 15 минут.
По 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии вносят в пробирки с 9 мл среды Кесслера-Свенартона. При переходе от одного разведения к другому стерильную пипетку надо менять. Посевы выращивают в термостате при температуре 43 0С (при отсутствии термостата на 43 0С можно выращивать при 37 0С). В случае задержки роста посев оставляют в термостате еще на 2 суток. Отсутствие через 18–24 часа газообразования и мути в бродильных сосудах служит окончательным отрицанием наличия кишечной палочки.
|
|
|
Результаты анализа выражают коли-индексом, т. е. количеством бактерий группы кишечной палочки, приходящимся на 1 г почвы и коли-титром – наименьшим количеством почвы, выраженным в граммах, внесение которого в питательную среду вызывает развитие бактерий группы кишечной палочки.
Определение титра анаэробов (Cl. perfringens) производится путем 9-кратных разведений основной почвенной суспензии, применяемой для определения коли-титра. Из каждого разведения берут стерильной пипеткой по 1 мл и заливают в пробирки с молоком, разлитым по 5 мл. Для освобождения от неспороносной микрофлоры все посевы с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане при 80 0С в течение 15 минут. Посевы выращивают в термостате при 37 0С (лучше при 43 0С) в течение 18–20 часов. Наличие Cl. perfringens регистрируется по наступившему характерному свертыванию молока с полным отделением сыворотки и выбрасыванию губчатого сгустка на поверхности благодаря энергичному газообразованию. Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний Cl. perfringens, показывает титр этого анаэроба в почве.
Присутствие Cl. perfringens подтверждается микроскопически нахождением в мазках из содержимого пробирок.
В почве определяют также титр термофилов. Термофильная сапрофитная микрофлора не свойственна биологически чистым почвам и попадает в них с навозом и компостами.
Гельминтологическое исследование почвы.
Отбор проб почвы . Для анализа на участке в 50 м2 возможного загрязнения фекалиями отбирают пробы почвы с глубины 2–3 см, а на вспаханных участках – с глубины до 25 см в зависимости от выращиваемых культур. На исследуемом участке берут по 200 г почвы в 9–10 точках по диагонали, с поверхности – шпателями или лопаткой, из глубоких слоев – лопатой или буром.
Отобранную почву помещают в полиэтиленовые мешочки и исследуют в ближайшие сутки. При необходимости пробы можно хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев. Для этого пробы помещают в широкие стеклянные банки, периодически увлажняют их водой и изредка перемешивают (для лучшей аэрации). При хранении проб в условиях комнатной температуры их необходимо залить 3 %-ным раствором формалина или 1–2 %-ным раствором соляной кислоты.
Исследование на яйца гельминтов. Из образца почвы отбирают примерно 200 г и распределяют на стекле. После перемешивания и разравнивания из разных мест слоя почвы берут в общей сложности около 10 г и помещают в толстостенную колбу. Затем навеску почвы с помощью стеклянных бус тщательно смешивают (в течение часа) с 20 мл 5 %-ного раствора гидроксида натрия.
Полученную смесь в течение 1–2 минут центрифугируют, и избыток щелочи сливают. Осадок тщательно смешивают с насыщенным раствором нитрата натрия (плотность 1,4 г/см3) и центрифугируют по 2 минуты не менее 5 раз.
После каждого центрифугирования поверхностную пленку снимают и переносят в стаканчик с небольшим количеством воды.
Содержимое стаканчика фильтруют, фильтры исследуют под микроскопом во влажном состоянии, и яйца гельминтов легко обнаруживаются в поле зрения. Для более детального морфологического изучения яиц делают соскоб содержимого фильтра на предметное стекло в каплю 50 %-ного глицерина и рассматривают под микроскопом.
Исследование на личинки гельминтов. 200–400 г почвы тщательно измельчают и размещают равномерно на кусочке марли, который помещают в металлическое сито с отверстиями 1–2 мм в диаметре. Сито вставляют в стеклянную воронку, наполненную водой (45 0С) так, чтобы нижняя часть сита была погружена в воду. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом, над которым собираются личинки в силу термотропности, мигрирующие из почвы в теплую воду. Через 4–20 часов от начала анализа открывают зажим и выпускают 50 мл жидкости, которую центрифугируют, и осадок исследуют под микроскопом.
Санитарно-энтомологическое исследование почвы.
Для определения загрязнения почвы исследуют наличие в ней личинок и куколок мух, которые проделывают в почве один из циклов своего развития.
Для исследования пользуются рамой–трафаретом размером 25х25 см2, накладываемой на поверхность участка почвы. Внутри трафарета выкапывают почву на глубину 20 см и рассыпают на ровной поверхности. Личинки и куколки вынимают пинцетом и подсчитывают их количество. Результат исследований оценивают по пятибалльной шкале: личинок нет – 1 балл, отдельные экземпляры личинок – 2, личинок мало – 3, личинок много – 4 и личинок очень много (кишат) – 5.
Санитарную оценку степени загрязнения почвы по результатам бактериологического и гельминтологического анализов можно проводить по таблице 14.
Таблица 14
Показатели санитарного состояния почвы
(при отборе проб с глубины 0–20 см)
| Степень опасности | Безопас-ная | Относительно безопасная | Опасная | Чрезвычайно опасная |
| Степень загрязнения | Чистая | Слабо загрязненная | Загрязненная | Сильно загрязненная |
| Общее число бактерий в 1 г почвы | менее 1000 | десятки тысяч | сотни тысяч | миллионы |
| Коли-титр, г |  1,0
| 1,0-0,01 | 0,01-0,001 | <0,001 |
| Титр анаэробов, г |  0,1
| 0,1-0,001 | 0,001-0,0001 | <0,0001 |
| Число яиц гельминтов в 1 кг почвы | 0 | до 10 | 11-100 | >100 |
| Санитарное число | 0,98-1,0 | 0,86-0,97 | 0,7-0,86 | < 0, 7 |
| Показатели загрязнения: | ||||
| - химическими веществами (кратность превышения ПДК) |  1
| до 10 | 10-100 | >100 |
| - радиоактивными веществами (кратность превышения естественного фона) | 1
| 1-1,5 | 1,5-3 | >3 |
| Показатель самоочищения почвы: титр термофилов, г | 0,01-0,001 | 0,001-0,00002 | 0,00002-0,00001 | <0,00001 |
Контрольные вопросы. 1.Как производят отбор проб почвы для бактериологического, гельминтологического, энтомологического исследований?
2. Методы исследований биологических свойств почвы. 3. Какие исследования входят в состав санитарно-бактериологического анализа? 4. Исследования на наличие яиц и личинок гельминтов. 5. Провести санитарную оценку степени загрязнения почвы по результатам бактериологического и гельминтологического анализов.
Раздел III
Дата добавления: 2021-04-07; просмотров: 194; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!