Дополнительный материал к занятию
Занятие 10
«Приготовление специальных, элективных и дифференциально-диагностических сред. Определение рН, разливка и стерилизация питательных сред»
Дополнительный материал к занятию
Питательные среды
По происхождению среды подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. К естественным питательным средам относятся натуральные продукты животного или растительного происхождения – молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовятся по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.
По составу среды делятся на простые и сложные. К простым средам относятся такие, как мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ). Сложные среды в своём составе содержат различные дополнительные компоненты, необходимые для роста микроорганизмов.
По консистенции среды подразделяют на жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физико-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена в микробиологической промышленности. Полужидкие среды обычно используют для длительного хранения культур. Они содержат в своём составе 0,5-0,7% агар-агара, который в настоящее время используют в качестве уплотнителей для питательных сред. Агар-агар представляет собой полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гель, плавящийся при 1000С и уплотняющийся при 450С и ниже. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата.Плотные среды, содержащие 1,5-2% агар-агара, применяются для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, количественного учёта, определения антагонистических свойств и других целей. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.
|
|
|
Питательные среды по целевому назначению могут быть разделены на основные, специальные, элективные и дифференциально-диагностические. Основные питательные среды: мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар. Специальные питательные среды применяются для выращивания тех микробов, которые не могут расти на основных средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка. Элективные питательные среды применяются для выделения одного какого-либо вида микроорганизма из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растёт на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; а рост других бактерий задерживается. Например, свёрнутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочек брюшного тифа, солевые среды для стафилококка. Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других на основании их биохимических свойств. В этих средах в качестве основы применяют разнообразные органические и неорганические соединения: питательный бульон или 1% пептонную воду. К ним добавляют углеводы, спирты, мочевину и другие вещества; при расщеплении которых происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону, что изменяет цвет индикатора, также входящего в состав среды.
|
|
|
Контрольные вопросы
Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и минеральных веществ. Источники азота, углерода. Факторы роста. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм? Особенности обмена веществ бактерий. Ферменты бактерий. Механизм расщепления веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Каковы типы питания патогенных микробов? Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? Классификация питательных сред по консистенции, по целевому назначению. Основные питательные среды. Что такое рост микробов, размножение микробов? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде (начертить кривую). Размножение бактерий в непрерывно–проточной среде. Условия культивирования бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм? Особенности биологического окисления у микробов. Группы микробов по типу биологического окисления. Каковы различия между аэробным и анаэробным типом (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления). Перечислите патогенные анаэробы. Что такое окислительно-восстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие - при более высоких? Типы брожения. Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется? Что такое психрофилы, мезофилы, термофилы? Оптимальная температура для роста патогенных микробов.
|
|
|
|
|
|
Дополнительный материал к занятию
Питательные среды
Дифференциально-диагностические среды делят на 4 основные группы:
1. Среды, содержащие белки , дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментови токсинов (кровь, желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств: кровяной агар (КА), среда с желатином, молоко, желточно-солевой агар (ЖСА).
2. Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты и индикаторы: ферментативное расщепление субстрата приводит к сдвигу рН и изменению окраски индикатора. Например, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среды Гисса, среда Олькеницкого.
3. Среды для дифференциации микробов по редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красителями, обесцвечивающимися при восстановлении, а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий.
4. Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий.Наиболее распространёнными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.
Определение рН питательных сред проводят потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода.
Калибровка и проверка рН-метра (потенциометра). Подготовка рН-метра и электродной системы производится согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Перед работой на потенциометре необходимо, пользуясь стандартными буферными растворами со значениями рН 4,01; 6,86; 9,18 при 25 °С, провести калибровку прибора*. Для приготовления таких растворов могут быть использованы фиксаналы (ГОСТ 8.135-74**). Различие между показанием прибора и номинальным значением рН буферного раствора не должно превышать 0,04 единицы рН.
_______________
* Если рН контролируемого раствора отличается менее чем на единицу от рН стандартного буферного раствора, то достаточна проверка прибора по одному буферному раствору, величина рН которого лежит в том же диапазоне измерения, что и значения рН контролируемого раствора. Если рН контролируемых растворов находятся в широких пределах, то проверку рН-метра следует производить по двум (трем) стандартным буферным растворам в соответствии с инструкцией.
** На территории Российской Федерации действует ГОСТ 8.135-2004. - Примечание изготовителя базы данных.
При измерении рН контролируемых растворов отсчет величины рН по шкале прибора производят после того, как показания прибора примут установившееся значение. Время установления показаний определяется буферными свойствами и температурой раствора (обычно время установления показаний не превышает 2 мин). Определение рН проводят при (25±2) °С, в противном случае необходимо сделать соответствующие поправки (подвести ручку термокомпенсатора либо использовать коэффициент пересчета). При измерении рН агаровых сред следует иметь ввиду, что полученные значения рН являются условными.
Оценку значения рН питательных сред необходимо проводить с учетом последующей стерилизации.
Примечание: автоклавирование, как правило, приводит к снижению рН, поэтому перед стерилизацией рН среды повышают на 0,2 единицы от требуемой величины, а после автоклавирования реакцию среды проверяют повторно.
Метод измерения рН
Подготовка проб:
в готовых жидких средах и гидролизатах определение рН проводят непосредственно в растворе;
для готовых плотных агаровых сред определение рН проводят в расплавленном и охлажденном до 45-50 °С препарате (необходимо особо тщательно отмывать электрод после измерения рН в агаризованных средах теплой (50-60 °С) дистиллированной водой; предпочтительно для этих сред пользоваться специально выделенным рН-метром). Возможно также определение рН в экстракте, приготовленном добавлением к 2,00 г измельченного студня 100 мл дистиллированной воды (рН 7,0-7,2), настаивания в течение 1 ч при температуре 18-25 °С с периодическим перемешиванием стеклянной палочкой и последующим фильтрованием через бумажный фильтр;
для сухих препаратов, не содержащих агар, определение рН проводят в 2%-м растворе, приготовленном добавлением к 2,00 г сухого препарата 100 мл дистиллированной воды, перемешиванием и последующим фильтрованием через бумажный фильтр;
сухих препаратов, содержащих агар, определение рН проводят в экстракте, приготовленном добавлением к 2,00 г сухого препарата 100 мл дистиллированной воды, настаиванием с периодическим перемешиванием в течение 1 ч при температуре 18-25 °С и последующим фильтрованием через бумажный фильтр.
Разливка питательных сред производится при помощи стеклянной воронки, на конец которой надевают кусочек резиновой трубки со стеклянным наконечником с оттянутым концом. Резиновая трубка зажимается зажимом Мора. Воронка укрепляется на штативе, в нее наливается среда, которая затем разливается в предназначенную для этого посуду. При разливании агаровых сред в пробирки надо следить за тем, чтобы их края не были смочены средой, так как пробки после стерилизации могут присыхать к пробиркам. Поэтому создается не только затруднение при открывании, но и просвет пробирки заполняется торчащими волокнами ваты. При необходимости разливать точно дозированное количество среды пользуются специальным разливательным аппаратом Трескова или смонтированной по его принципу разливательной воронкой. Последняя состоит из стеклянной воронки и градуированного цилиндрика, соединенных при помощи резиновых трубок со стеклянным тройником, на одно колено которого надет кусок резиновой трубки с оттянутой стеклянной трубочкой. На резиновую трубку, соединяющую воронку с тройником, надет зажим Мора, а на нижнюю трубку – второй. Открывая первый зажим, заполняют цилиндрик до определенной метки, а затем, нажав второй зажим, выпускают определенное количество жидкости в пробирку.
Можно смонтировать и более простой разливательный прибор, состоящий из воронки и градуированной бюретки, соединенных резиновой трубочкой, зажатой на конце зажимом Мора.
Контрольные вопросы
Классификация питательных сред по консистенции, по целевому назначению. Требования, предъявляемые к питательным средам. Основные питательные среды. Специальные питательные среды, их названия; для каких бактерий предназначены? Элективные питательные среды, состав, применение. Приведите примеры. Дифференциально-диагностические среды, их названия; для чего применяются? Приготовление питательных сред. Методика определения рН питательной среды. Приготовление растворов с определенным значением рН. Фильтрование питательных сред. Осветление питательных сред. Разливка питательных сред. Стерилизация питательных сред.
ЗАНЯТИЕ 11
«Оценка качества питательных средств на всхожесть, ингибирующие свойства. Методика определения концентрации и жизнеспособности бактерий. Определение аминного азота и оценка стерильности»
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 202; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!