ГЛАВА 5. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
ГОМОГЕНИЗАЦИЯ ПРОБ И ПРОБОПОДГОТОВКА
______________________________
В главе представлены традиционные и современные методы, отличающиеся повышенной точностью, чувствительностью и селективностью. Представить полный перечень методов культивирования микроорганизмов весьма затруднительно, так как их постоянно совершенствуют. Можно с уверенностью сказать, что возможности той или иной области науки продиктованы в первую очередь используемыми в ней методами и материал, представленный здесь, крайне важен для пищевой микробиологии.
Принципиальной основой пищевой микробиологии являются методы анализа пищевых продуктов на наличие и количество микроорганизмов или их метаболитов.Тем не менее, одним методов невозможно определить достоверное число разных групп микроорганизмов в пищевом продукте, так как каждый метод ограничен в своих функциях.
Гомогенизация - процесс уменьшения неоднородности смесей, состоящих из твердых веществ в текучей среде (жидкостях или газах) путем измельчения и равномерного перераспределения их по объему. Например, при помощи гомогенизации, жир в молоке может быть разбит так тщательно, что частицы повторно не рекомбинируются, и сливки не образуются.
Техника гомогенизации состоит из следующих способов:
перемешивание дисперсных систем с жидкой дисперсионной средой быстро вращающимся ротором диспергатора или венчиком;
|
|
|
прокачивание дисперсных систем типа жидкость/жидкость (например, молока) под давлением до 5-400 атмосфер через отверстие головки гомогенизатора, возникающие при этом гидродинамические силы дробят фрагменты дисперсной фазы на более мелкие;
перемешивание порошков в многоосных, в Y-образных или в Z-образных смесителях;
ультразвуковая кавитационная гомогенизация дисперсных систем газ/жидкость и жидкость/газ.
Любая проба, доставленная в лабораторию, нуждается в дополнительной гомогенизации перед ее сокращением — в противном случае ее представительность не может быть гарантирована. Если неоднородность пробы (наличие в ней различных фаз) видна на глаз, то качество гомогенизации может определять качество результатов анализа в целом. Стандартные рабочие методики, описывающие стадию подготовки пробы, должны предусматривать разнообразные способы гомогенизации. При оценке общей погрешности результатов необходимо количественно оценить погрешность, связанную со стадией сокращения пробы. Последняя погрешность определяет число сокращенных проб, которые следует проанализировать, чтобы достичь требуемой точности результатов анализа.
Для выполнения процедур пробоподготовки используется необходимое основное оборудование.
|
|
|
Вплоть до конца 1970-х гг. образцы перед посевом почти исключительно измельчали механически путем растирания, разрезания на мелкие кусочки и т.п.. A.N. Sharpe и A.K. Jackson в 1971 г.разработали устройство для гомогенизации пищевых продуктов. Гомогенизатор -механическое устройство, которое за счет физического воздействия измельчает образец.Сущность механического воздействиязаключается в гомогенизации образцов; высвобождающиеся микроорганизмы переходят в растворитель и формируют равномерную суспензию(рис.5.1.).
Рис.5.1. Гомогенизатор Stomacher лабораторный ECOBlenderII (PBI)
Гомогенизатор Stomacher можно сравнить с блендером, котрый также используют для гомогенизации пищевых продуктов.
Результаты определения числа микроорганизмов в образцах, гомогенезированных на Stomacher, не отличаются от такового для образцов, подготовленных блендером. Устройство выгодно отличается от блендера следующими характеристиками: 1) не требуется очищать части блендера; 2) сохраняется температура образца; 3) подготовленные образцыможно сохранить в Stomacher в замороженном виде для дальнейшего исследования; 4) устройство создает меньше шума, чем блендер.
Stomacher предпочтителен для продуктов питания.
|
|
|
1) При гомогенизации мяса с использованием Stomacher не происходит обширное разрушение тканей мяса, и как следствие, в составе гомогената в меньшем количестве присутствовали восстанавливающие компоненты, взаимодействующие с резазурином; тогда как при перемешивании уровень восстанавливающих компонентов, взаимодействующих с резузурином, был значительно выше.
2) Устройство под названием «Pulsifier» сходно со Stomacher.В нем создается уровень турбулентности, позволяющий более полно извлечь из продукта микроорганизмы.
3) Гомогенизатор Pulsifier имеет электромотор, приводящий в движение ударное кольцо из нержавеющей стали, которое дополнительно вибрирует для интенсивного перемешивания/взбалтывания пробы. Это обеспечивает максимальный переход микроорганизмов из образца в суспензию, не деформируя продукт. Он позволяет произвести подготовку пробы с максимальной экстракцией бактериальных клеток.
4) Проба помещается в специальный пакет, который плотно запеча-тывается во избежание попадания в окружающее пространство аэрозоля, содержащего бактерии. За процессом гомогенизации можно наблюдать через прозрачное окно. Контрольная LCD панель позволяет устанавливать программу или время, а также имеет кнопку «Пауза», чтобы иметь возможность остановить процесс и затем продолжить его, не начиная заново.
|
|
|
5) Гомогенизатора Pulsifier имеет следующие преимущества:
· суспензия более чистая и менее густая, чем при обработке другими приборами.
· образец после обработки содержит меньше пищевых частиц.
· образцы более пригодны для молекулярных методов исследования.
· затрачивается меньше времени на подготовку образца.
Для подсчета числа микроорганизмов пользуются следующими методами исследования: СПК- стандартный подсчет колоний, КОЕ – определение колониеобразующих единиц , АПК- аэробный подсчет колоний ; • НВЧ –наиболее вероятное число жизнеспособных клеток; подсчет числа жизнеспособных клеток, обладающих редуктазной системой; прямой подсчет микроорганизмов.
СТАНДАРТНЫЙ ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ
Сущность метода заключается в подсчете жизнеспособных микроорганизмов посевом на питательные среды, где микробные клетки в процессе деления образуют колонии видимые невооруженным глазом.
Метод стандартного подсчета колоний (СПК) предусматривает измельчение и гомогенизацию образца пищевых продуктов, его растворение в растворителе. Затем конкретное количество гомогената, разбавленного в растворителе высевают на агаровую среду (поверхностным или глубинным методами) и инкубируют при соответствующей температуре в течение определенного времени. Потом подсчитывают все видимые колонии с использованием счетчика колоний.
Количество обнаруживаемых микроорганизмов рассмотривается как функция факторов: систематическая группа микробиоты продукта; избранный метод исследования; история пищевого продукта до исследовния; состав плотных питательных сред; температура, время инкубирования; рН, влажность и окислительно-восстановительный потенциал плотных питательных сред; относительное количество микроорганизмов в образце; наличие других конкурентных или антагонистических организмов.
СПК чаще всего осуществляется глубинным посевом,однако нельзя исключать использование поверхностного посева, потому что результаты обоих методов вполне сравнимы. Растворенный методом серийных разведений образец в количестве 0,1, 0,5 или 1,0 мл наносятся на поверхность питательной среды. Затем с помощью изогнутого стеклянного или пластикового шпателя образец круговыми движениями равномерно распределяется по всей поверхности. При этом методе посева сохраняются чувствительные к высокой температуре психрофилы в пищевых продуктах, потому что микроорганизмы не попадают в контакт с горячим расплавленным агаром. Для строгих аэробов предпочтителен поверхностный посев, но микроаэрофильные организмы при таком посеве имеют тенденцию расти медленнее. При посеве на поверность агаровой пластинки необходимо равномерное растирание инокулята, чего трудно добиться на влажной поверхности. Избежать это неудобство можно кратковременным подсушиванием агаризированной среды в боксе.
СПИРАЛЬНЫЙ ПЛОТТЕР
Метод спирального плоттера (спирального посева) – это метод учета жизнеспособных микроорганизмов. Спиральный плоттер – это прибор, равномерно распределяющий тонкой струей суспензию гомогената по поверхности питательной среды в чашке Петри (рис..5.2.).
Рис.5.2. Спиральный плоттерEddy Jet 2
От центра пластины к ее краям, распределяя образец по архимедовой спирали, перемещается распределяющее устройство (рука), которое специальным прикрепленным шприцом отливает непрерывно уменьшающийся объем образца так, что концентрация в центре и у края достигает соотношения 10000:1. Инкубация посева в термостате показывает по количеству колоний на постоянную более высокую плотность вносимых микроорганизмов в центре пластины, в отличие от края.При посеве образца с помощью спирального плоттера выросшие колонии считают, используя так называемую сетку для подсчета (рис. 5.3.).
Рис.5.3.Сетка для подсчета колоний
Спиральный плоттер предпочтительней, так как экономится время исследования, питательная среда и лабораторная посуда.Прибор в основном используют для исследованийтаких продуктов, какмолоко. Для использования плоттера разработали лазерный счетчик. Высокая стоимостьприборатребует его использованиедля анализа большого числа образцов. Метод описан в работе Сousin, M.A., J.M. Jay, and P.C. Vasavada (2001).
Метод спирального посева образцов является широко распространенной в микробиологии техникой, которая была разработана для сокращения количества чашек Петри с питательной средой, используемых для поверхностных посевов. Метод спирального посева позволяет не выполнять серийные разбавления образца, которые необходимы при традиционном способе посева, и которые отнимают много времени. Один спиральный посев позволяет сэкономить 3 чашки питательной среды, что существенно сокращает время операции и расход материалов.
Спиральный посев образцов проводится по так называемой Архимедовой спирали. Объем пробы, нанесенный вдоль спирали экспоненциально уменьшается так, что один посев содержит несколько концентраций образца, распределенных вдоль спирали. После инкубации, результат учитывают с помощью специальной учетной сетки (вручную) или автоматически с помощью автоматического счетчика колоний.
В приборе Eddy Jet 2 (производитель IUL) реализован новый подход который заключается в использовании для нанесения материала образца стерилизованных γ-радиацией одноразовых микрошприцов, что предотвращает перекрестную контаминацию. Использование стерильных микрошприцев делает ненужными этапы очистки, что позволяет сэкономить большое количество времени.
МЕМБРАННЫЕ ФИЛЬТРЫ
Мембраны с размером пор около 0,45 мкм позволяют при фильтрации растворенной пробы задерживать бактерии, но пропускать воду или растворитель. В результате фильтрации на фильтре накапливаются бактериии мембрану помещают на агаровую пластину, содержащую питательный субстрат, и термостатируют. Затем производят подсчет колоний.
Техника прямого флуоресцентногофильтрования. Подготовленный образец продукта фильтруют, используя фильтр с порами диаметром 5мкм. Фильтрат обрабатывают тритона и трипсином для растворения соматических клеток. Затем фильтраты термостатируют и фильтруют через мембраны 0,6 мкм.Фильтрат окрашивают флуорохромами. В высушенных мазочкахподсчитываютклетки с помощью люминесцентного микроскопа.Метод позволяет определять от 6 000 КОЕ/г в мясных и молочных продуктах.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 307; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!