Механизм, цели применения реакции иммунофлюоресценции (РИФ), виды РИФ, ингредиенты
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. РИФ основана на использовании флюоресцеинизотиоцианата ¾ ФИТЦ или других флюорохромов, химически связанных, конъюгированных с АТ. При этом меченые АТ сохраняют иммунологическую специфичность и вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными АГ.
Различают две основные разновидности метода: прямой и непрямой.
Прямой метод РИФоснован на том, что антигены тканей или микробы, обработанные специфичными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого или желтого цвета.
Непрямой метод РНИФзаключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из исследуемых микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
|
|
|
Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты
Иммуноферментный анализ (ИФА) используется для выявлениямикробных антигенов или противомикробных антител с помощью антител, конъюгированных с ферментной меткой (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой). После соединения иммунного комплекса с меченной ферментом иммунной сывороткой добавляют субстратно-хромогенрую смесь. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции. При этом интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.ИФАприменяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в низких концентрациях ¾ 10-10 -10-12 г/л.
Твердофазный ИФАявляется наиболее распространенным вариантом ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропланшетов из полистирола (рис. 25). При определении антител в лунки микропланшетов с сорбированными антигенами последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, субстрат для фермента (Н2О2 или фосфатид) и хромоген (индикатор, окрашивающий продукт ферментации). Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента и хромоген.
|
|
|
Рис. 25. Принцип постановки ИФА для обнаружения антимикробных антител
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 576; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!