Реакция связывания комплемента (РСК): этапы реакции, методика определения рабочей дозы комплемента, подготовка гемолитической системы
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при наличии специфичности антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, то есть происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза ¾ инкубация смеси, содержащей три компонента: антиген, антитело и комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело (специфичности антигена и антител) происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет, реакция считается положительной. Если специфичность антигена и антител не соответствуют друг другу, то комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз, реакция считается отрицательной. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности риккетсиозов, гонореи, коклюша, сифилиса (реакция Вассермана).
3. Реакции нейтрализации
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтра лизацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.
|
|
|
III. План практической работы
1. Изучить технику постановки и учесть реакцию преципитации (РП) в геле с целью определения токсигенности дифтерийной палочки (РН токсина антитоксической сывороткой).
Полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой, накладывают на поверхность прозрачного агара в чашке Петри. Культуры дифтерийной палочки сеют бляшками на расстоянии 0,6-0,8 см от полоски фильтровальной бумаги и 1-1,5 см друг от друга. Исследуемые и контрольную (токсигенную) культуры дифтерийной палочки чередуют с одной стороны полоски фильтровальной бумаги, а напротив, с другой стороны полоски сеют одноименные культуры (дубли). Чашку инкубируют при 37ºС в течение 24-48 часов. Затем проводят учет. Положительной реакция считается при наличии тонкой линии преципитата между полоской фильтровальной бумаги и ростом бактерий в виде бляшки, отрицательной ¾ при её отсутствии. Реакция считается специфичной, если контрольная культура дала положительный результат.
|
|
|
2. Поставить и учесть реакцию кольцепреципитации Асколи в диагностике сибирской язвы (с целью обнаружения антигенов возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале).
Из органов трупа животного (селезенки, участков воспаления и геморрагий кишечной стенки, легких) готовят термоэкстракт, путем кипячения в изотоническом растворе хлорида натрия и фильтрования, возможно содержащий термостабильный антиген возбудителя сибирской язвы. Реакцию ставят в узких преципитационных пробирках, внося равные объемы (0,3-0,5 мл) каждого компонента, причем второй компонент реакции осторожно наслаивают на первый, наклоняя пробирку под углом 45º. Реакция ставится согласно схеме (таблица).
| Ингредиенты | Рабочая пробирка | Отрицательный контроль сыворотки | Положительный контроль сыворотки | Контроль термоэкстракта |
| Исследуемый материал (термоэкстракт из органов животного) | + | + | ||
| Диагностикум (стандартный сибиреязвенный антиген) | + | |||
| Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (на дно) | + | + | + | |
| Нормальная сыворотка животного (на дно) | + | |||
| Изотонический раствор NaCl | + |
В случае наличия антигенов возбудителя сибирской язвы втермоэкстрактена границе между жидкостями появляется мутно-белое кольцо преципитата не позднее, чем через 15 минут.
|
|
|
3. Изучить схему постановки и учесть РСК в серодиагностике сыпного тифа.
Реакция связывания комплемента (РСК) ¾ это сложная многокомпонентная серологическая реакция, в которой используются две системы AГ- AT (исследуемая и индикаторная) и комплемент в рабочей дозе.
Первую систему называют исследуемой или тест-системой, она содержит один неизвестный компонент (исследуемая сыворотка, в которой определяется наличие антител) и известный компонент (диагностикум). Вторую систему называют индикаторной или гемолитической (эритроциты барана + антитела сыворотки кролика). РСК проходит в два этапа:
1) тест-система (№1) + комплемент ¾ 1 час инкубации при 37ºС
|
|
|
2) добавляют гемолитическую систему (№ 2) ¾ 1 час инкубации при 37ºС
РСК имеет много компонентов, поэтому ставят несколько контролей. Все компоненты используют в эквивалентных количествах. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента для определения его рабочей дозы, так как при этой реакции необходимо точное соблюдение количественных соотношений ингредиентов.
Титрование комплемента
Из коммерческого препарата комплемента, представляющего собой лиофилизированную сыворотку крови морской свинки, готовят разведения 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35 и 1:40. К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% суспензии эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика в тройном титре после их инкубации в течение 30 минут). После инкубации пробирок 30 минут при 37ºС определяют титр комплемента – наибольшее его разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в гемолитической системе. В реакции РСК используют рабочую дозу комплемента, которая на 25% больше, чем титр комплемента.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 756; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!