Влияние разных способов получения спермы на ее качественные и количественные показатели

Показатели	Группы животных		Разница	td
	Контрольная	Опытная
Объем спермы, мл	219 ±2,2	255 ±2,7	36 ±3,5	13,7
Концентрация сперми- ев, млн/мл	235 ±4,3	236 ±3,9	1±5,8	0,17
Общее число спермиев, млрд	51,4 ± 1,0	60,2 ± 1,4	8,4 ±1,7	4,94
Подвижность спермиев, %	80,2 ±0,1	81,0 ±0,2	0,8 ± 0,22	3,6
Резистентность, усл. ед.	950 ±60	1205 ±71	255 ±93,0	2,74
Переживаемость спер- миев, ч	57,8 ±1,2	65,6 ±2,3	7,8 ± 2,6	3,0
Сохранность акросом, %	84,5 ±7,1	86,3 ± 6,9	1,8 ±9,9	0,18
Активность ACT в плазме спермы, ед.	18,9 ±0,9	16,1 ±0,6	2,8 ±1,1	2,6

Из табл. 26 следует, что взятие спермы как на вагину, так и мануальным методом не оказывает влияния на концентрацию спермиев в эякулятах хряков, однако при получении спермы с помощью спецустройства объем спермы в среднем был выше на 16,4 %.

Подвижность спермиев также была одинаковой, однако ре- зистентность была выше на 26,8 %, переживаемость – на 7–8 ч, а также наблюдалась несколько лучшая сохранность акросом спермиев и снижение утечки трансаминаз. Возможно, это про- исходит из-за того, что конструкция устройства препятствует проникновению микрофлоры в сперму при ее получении.

Таким образом, применение спецустройства для взятия спермы мануальным способом способствует получению боль- шего количества спермы, улучшению ее качественных и коли- чественных показателей.

Данный способ получения спермы менее трудоемок, более технологичен, оправдан с экономической точки зрения по срав- нению со взятием на искусственную вагину и может быть ис- пользован для получения спермы от хряков.

 

Оценка качества спермы

Результативность искусственного осеменения свиноматок в значительной степени зависит от своевременной и правильной оценки количественных и качественных показателей спермы. Сперму хряков оценивают по нескольким показателям. Нор- мальная сперма имеет цвет разбавленного молока и не должна содержать примесей крови, гноя и мочи. В дальнейшем опреде- ляют объем эякулята. Для этого сперму фильтруют через 3–4 слоя стерильной марли. Секрет куперовых желез удаляют и учитывают объем профильтрованной спермы.

Хряки выделяют за одну садку от 100 до 600 мл спермы, бывают случаи – до 1000 мл. Густоту определяют глазомерно под микроскопом. Для этого на предметное стекло наносят кап- лю спермы, покрывают ее покровным стеклом и рассматривают под микроскопом при увеличении в 180–280 раз. Различают

густую, среднюю и редкую сперму. В густой сперме поле зре- ния заполнено большим количеством сперматозоидов с незна- чительными промежутками между ними. В средней по густоте сперме промежутки между сперматозоидами очень заметны, а в редкой сперме в промежутках свободно могли бы передвигаться другие спермии. В густой сперме в 1 мл содержится более 210 млн спермиев, в средней – от 110 млн до 210 млн, в редкой – до 110 млн (рис. 2).

Рис. 2. Густота спермы хряков при глазомерной оценке: Г — густая; С — средняя; Р — редкая

 

Определение концентрации спермиев в сперме хряка. Концентрацию спермиев в сперме определяют с помощью счет- ной камеры Горяева, фотоэлектроколориметра или оптического стандарта С.И. Сердюка.

Определение концентрации спермиев с помощью счет- ной камеры. Подсчет спермиев производят в счетной камере, применяемой для определения числа форменных элементов крови (с сеткой Горяева). Камера должна быть предварительно вымыта и насухо вытерта мягкой чистой салфеткой. Накрывают камеру покровным стеклом и притирают его до появления ра- дужных колец.

Для спермиев хряка применяют эритроцитарный смеситель (меланжер) с белым шариком. В меланжер через резиновую трубку, соединенную с верхним концом смесителя, набирают сперму хряка – до метки 0,5, а затем 3 %-ный раствор натрия хлористого – до метки 11. Зажимают большим и указательным пальцами оба конца смесителя и встряхивают его в течение 2–3 мин до полного смешения спермы с раствором.

Из капилляра меланжера удаляют первые четыре капли (где нет спермиев), а пятую каплю подносят к щели между покров- ным стеклом и средней площадкой камеры. Сперма заполняет пространство между средней площадкой и покровным стеклом.

Камеру помещают на столик микроскопа таким образом, чтобы в поле зрения помещался один большой квадрат сетки камеры (увеличение × 200).

Число сперматозоидов подсчитывают в пяти больших квад- ратах (80 малых) по диагонали. Считают головки спермиев внутри малых квадратов, а также на их левых и верхних лини- ях.

Суммарное число спермиев в 80 малых квадратах выражает концентрацию их миллионов в мл (млн/мл).

Концентрацию спермиев вычисляют по формуле:

 

С

,

 

где С – концентрация спермиев;

n – число спермиев, сосчитанное в 80-ти малых квадратах;

D – степень разбавления спермы в смесителе;

N – число малых квадратов, в которых произведен подсчет;

Р – глубина камеры, равная 1/10 мм;

400 – число малых квадратов на площади 1 мм2.

После работы смесители, камеры, предметные и покровные стекла тщательно моют сначала простой, а затем дистиллиро- ванной водой, меланжеры, кроме того, промывают 96° спиртом и просушивают эфиром, после чего резиновыми шарами проду- вают воздух, высушивая его. Концентрацию спермиев в сперме можно также определять с помощью фотоэлектроколориметра. При использовании этого метода надо предварительно состав- лять калибровочную кривую и строго выполнять указания по использованию прибора.

Для работы надо иметь: 1) 3,4%-ный раствор лимонно- кислого натра. 2) Мерные пипетки на 0,1 мл и 10 мл. 3) Кюветы (3 штуки) с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. 4) Зе-

леный светофильтр. 5) Фотоэлектроколориметр марки ФЭК-М.

6) Чистые сухие пенициллиновые флаконы по числу исследуе- мых эякулятов. Перед началом работы на флаконы прикрепляют этикетки с указанием кличек хряков. Затем готовят 3,4 %-ный раствор лимонно-кислого натра (трехзамещенного, пятиводно- го). Раствор фильтруют через бумажный или ватный фильтр. За 15–20 мин до начала измерений включают фотоэлектроколори- метр (ФЭК-М) и вставляют зеленый фильтр.

В пенициллиновые флаконы (по числу исследуемых эякуля- тов) из пипетки или бюретки наливают 10 мл 3,4 %-ного рас- твора цитрата. Затем из спермоприемника тщательно пипеткой отмеряют 0,1–0,2 мл спермы и переносят ее в подготовленный флакон. На флаконе подписывают кличку хряка и номер иссле- дуемого эякулята. Содержимое флакона тщательно перемеши- вают встряхиванием до равномерного распределения спермы в растворе. При проведении измерений надо пользоваться тремя кюветами с рабочей длиной 10 мм. Кюветы хорошо моют дис- тиллированной водой и снаружи вытирают чистой салфеткой. Влагу внутри кюветы отсасывают фильтровальной бумагой, предварительно наклонив кювету таким образом, чтобы капли влаги собрались в каком-либо углу края кюветы. Затем две кю- веты наполняют до метки раствором лимонно-кислого натра, а в третью наливают из флакона разбавленную сперму. Одну кюве- ту с разбавителем помещают в гнездо левого кюветодержателя фотоэлектроколориметра, а другую — в гнездо правого. Затем индекс правого барабана устанавливают на нулевое деление шкалы оптической плотности. Включают гальванометр на ма- лую чувствительность. Вращением рукоятки нейтральных клиньев стрелку гальванометра устанавливают на нуль. Вклю- чают гальванометр на максимальную чувствительность. При смещении стрелки гальванометра вращением рукоятки ней- тральных клиньев возвращают ее в нулевое положение и снова переключают гальванометр на малую чувствительность.

После этого в свободный зажим правого кюветодержателя вставляют кювету с испытуемым образцом спермы. Поворотом кюветодержателя кювету со спермой вводят в правый пучок

света. Стрелка гальванометра отклоняется от нулевого положе- ния. Вращением измерительного барабана стрелку гальвано- метра постепенно подводят к нулю. Включают гальванометр на максимальную чувствительность, замечают отклонение стрелки и снова ставят ее на нуль вращением измерительного барабана. Рукоятку включения гальванометра снова ставят на малую чув- ствительность и отсчитывают по шкале правого барабана вели- чину оптической плотности.

Для определения зависимости оптической плотности от концентрации спермиев в испытуемой сперме строят градуиро- вочную кривую. Для этого из нескольких эякулятов выбирают тот, в котором концентрация спермиев при подсчете в счетной камере была наибольшей. Это нужно для того, чтобы из данно- го эякулята можно было приготовить целый ряд таких разведе- ний спермы (эталонов), которые бы охватывали область воз- можных концентраций всех эякулятов, подлежащих исследова- нию. Путем разбавления спермы 3,4 %-го раствора лимонно- кислого натрия получают ряд концентраций спермы: 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800 млн в 1 мл и т. д., причем каждый эталон помещают в отдельный флакон. Для контрольной проверки чис- ла спермиев в каждом эталоне сперму набирают в лейкоцитные смесители, подсчитывают в счетной камере 4–5 раз и опреде- ляют среднюю концентрацию. Одновременно проводят опреде- ление плотности полученных эталонов спермы с помощью фо- тоэлектроколориметра. Исходя из полученных данных, строят калибровочную кривую, где на горизонтальной оси откладыва- ют концентрацию эталонов, а на вертикальной оси – их плот- ность. В дальнейшем, определив плотность исследуемой спер- мы, находят по градуировочной кривой соответствующую кон- центрацию.

Определение концентрации спермиев в сперме хряка с помощью оптического стандарта. Концентрацию половых клеток в сперме хряков можно определить с помощью стандар- та, разработанного С.И. Сердюком (1963). Метод апробирован ВГНКИ ветпрепаратов, одобрен МСХ СССР и в настоящее вре- мя широко используется в практической работе станций и пунк- тов искусственного осеменения свиней.

Методика определения концентрации половых клеток в сперме хряков по оптическому стандарту заключается в сле- дующем. В прилагаемую к стандарту чистую пробирку (исполь- зование пробирок другого диаметра не допускается) наливают пипеткой 1 мл 1 %-ного раствора хлористого натрия. Затем микропипеткой набирают 0,1 мл свежевзятой профильтрован- ной через 3–4 слоя марли спермы. Конец микропипетки, кото- рый погружался в сперму, вытирают снаружи чистой марлей или ватой и вносят сперму в раствор. Микропипетку обязатель- но промывают в этом же растворе 1–2 раза. Пробирку слегка встряхивают, держат ее рядом со стандартом, который предва- рительно хорошо взбалтывают, а сзади вплотную приклады- вают газетный или книжный текст. Пробирку с исследуемой спермой и стандарт с приставленным текстом держат на уровне глаз против падающего света. Сравнивая со стандартом оптиче- скую плотность, к исследуемой сперме добавляют градуиро- ванной пипеткой 1 %-ный раствор хлористого натрия в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковыми со стандартом. При добавлении каждой час- ти раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси. После того как оптические плотности исследуемой спермы и стандарта уравняются, произ- водят расчет по следующей формуле:

К=50×(n + 0,1) млн,

где К — концентрация половых клеток, в млн/мл;

n — объем добавленного 1%-ного раствора хлористого на- трия, мл.

Стандарт соответствует оптической плотности спермы хря- ков с концентрацией спермиев 5 млн/мл. Сперма используется в том случае, если концентрация в ней спермиев не менее 100 млн/мл.

Определение подвижности спермиев. Одновременно с оп- ределением густоты спермы устанавливают и подвижность в ней спермиев. Для этого на чистое обезжиренное теплое пред- метное стекло наносят стеклянной палочкой каплю спермы, ук-

рывают ее покровным стеклом и исследуют под микроскопом при увеличении в 200–300 раз и температуре 40–42°С. Подвиж- ность определяют глазомерно по десятибалльной шкале. Если в поле зрения микроскопа все спермии движутся прямолинейно, то сперму оценивают в 10 баллов. Если таких спермиев 90 %, то подвижность обозначают в 9 баллов; при 80 % – 8 баллов; при 70 % – 7 баллов и т. д. Если в поле зрения микроскопа будет один спермий с прямолинейно поступательным движением на несколько десятков мертвых или с колебательными движения- ми, то подвижность обозначают буквой Е (единичные). Если все спермии имеют колебательное движение, то сперму обозначают буквой К (колебательное), если все спермии мертвые, то обо- значают буквой Н (некроспермия). К разбавлению и хранению допускается сперма хряка густая, средняя и редкая с подвижно- стью не ниже 7 баллов.

В последнее время выяснилось, что подвижность не всегда точно прогнозирует оплодотворяющую способность спермиев. Бывают случаи, когда сперма, обладающая высокой подвижно- стью, дает низкую оплодотворяемость. Это не значит, что от теста подвижности следует отказаться. Использование спермы с недостаточным числом подвижных спермиев – бессмысленно, но не всякий раз высокая подвижность гарантирует соответст- венно высокую оплодотворяющую способность. В связи с этим оценку на подвижность необходимо подкреплять тестами, более полно отражающими биологическую полноценность спермиев. Периодически 1 раз в месяц сперму каждого хряка следует про- верять на биологическую полноценность спермиев еще одним тестом, основанным на структурной целостности акросомы.

Метод оценки акросомы спермиев хряка. Акросома явля- ется важнейшей органеллой спермия, состояние которой в зна- чительной степени определяет их оплодотворяющую способ- ность. Это связано с тем, что внутри акросомы содержится фак- тор первого этапа оплодотворения – фермент гиалуронидаза, необходимый для разрыхления клеток лучистого венца яйце- клетки, скрепленного гиалуроновой кислотой. Кроме того, в ак- росоме содержится ингибитор другого важного фактора опло-

дотворения – трипсиноподобного фермента акрозина, который локализован под акросомой в протоплазме спермия и во внут- ренней ядерной мембране. Акрозин необходим для осуществ- ления второго этапа оплодотворения – проникновения спермия через прозрачную оболочку яйца. Акрозин разжижает неболь- шой участок в оболочке и открывает проход для проникнове- ния. Ингибиторы акрозина, содержащиеся в акросоме, не по- зволяют ферменту проявить свою активность раньше времени и произвести разрушительное действие на другие структуры спермия. Кроме того, неповрежденная акросома не дает вытечь акрозину во внешнюю среду. После контакта спермиев с яйце- клеткой происходит так называемая акросомная реакция – от- торжение акросомы, а с ней и ингибиторов акрозина, что обес- печивает возможность второго этапа оплодотворения.

Морфологически акросома формирует передний край го- ловки сперматозоидов и может быть выявлена микроскопиче- ски с использованием фазового контраста или флюоресценции. У спермиев хряка различают 4 стадии состояния акросомы:

1. Акросома в виде колпачка плотно обтягивает переднюю половину головки спермия. Передний край ее гладкий и с одной стороны головки образует заметное утолщение (так называемый апикальный или верхушечный валик). Поскольку валик форми- руется с одной стороны головки, его можно видеть лишь у по- ловины спермиев. Такая форма акросомы отражает ее нормаль- ное состояние. Однако из-за старения спермия или других при- чин акросома может быть подвергнута дегенеративным измене- ниям.

2. Набухание акросомы. Контур переднего края головки размытый, обозначается задняя часть акросомного колпачка, в целом акросома увеличена в размерах – ее контуры делают пе- реднюю половину головки шире задней, теряется оптическая плотность.

3. Передняя часть акросомы сильно деформирована, акро- сома выглядит в виде отдельных фрагментов.

4. Акросома потеряна спермиями полностью. Передняя по- ловина головки суженная, гладкая, оптически менее плотная по сравнению с задней.

Для обеспечения оплодотворяющей способности спермиев необходима морфологически нормальная акросома, находящая- ся в 1-й стадии.

Для определения состояния акросомы спермиев необходимо следующее оборудование:

1. Микроскоп биологический (Биолам Р-4 или Р-6, МБИ-1, МБР-1 и др.).

2. Фазово-контрастное устройство КФ-4 или КФ-5, вклю- чающее специальные конденсор и объектив 90   с масляной иммерсией, а также вспомогательный микроскоп МИР-1.

3. Осветитель ОИ-7, если используются микроскопы МБИ-1 и МБР-1.

4. Счетчик клавишный гематологический.

Настройка микроскопа.

1. Устанавливают освещение по Келлеру. Осветитель и электронную линзу располагают так, что получают резкое изо- бражение нити накала лампы в плоскости апертурной диафраг- мы конденсатора. На столик микроскопа кладут любой препарат и под объективом 90× с масляной иммерсией наводят на рез- кость изображение препарата при наблюдении в окуляр. Апер- турную диафрагму открывают полностью. Полевую диафрагму осветителя полностью закрывают и, перемещая конденсор вверх-вниз, строят резкое изображение ее в поле зрения. Изме- няя положение зеркала микроскопа, или центрировочными вин- тами осветителя, изображение полевой диафрагмы располагают точно в центре поля зрения и раскрывают ее до края поля зре- ния. В ход лучей конденсора вводят фазово-контрастное кольцо 90×. Вместо окуляра в тубус микроскопа вводят МИР-1 и на- страивают его так, чтобы были видны фазово-контрастные кольца конденсора и объектива. Центрировочными винтами конденсора совмещают кольцо конденсора с кольцом объектива. Вместо МИР в тубус вставляют окуляр.

2. Сперму в соотношении 1:10 разбавляют 3 %-ным раство- ром лимонно-кислого натрия и наносят каплю на тонкое пред- метное стекло (не более 2 мм), накрывают большим покровным стеклом (18×18 мм). Препарат кладут на столик микроскопа  и

наводят на резкость под объективом 90× с масляной инверсией. Подсчитывают в нескольких полях зрения 100 спермиев, разде- ляя популяцию на спермии с нормальной акросомой и с изме- ненной. Определяют процент спермиев с нормальной акросо- мой. Если подвижность спермиев затрудняет подсчет, в разбав- ленную сперму необходимо добавить каплю глютаральдегида или формалина. Если сперматозоиды движутся с током жидко- сти, нужно подождать 2–3 мин и дать возможность ей остано- виться.

Определение резистентности спермы. Резистентность

(R) – показатель устойчивости сперматозоидов против 1 %-ного хлористого натрия. Она выражается количеством (мл) 1 %-ного раствора хлористого натрия, которое необходимо прибавить к 1 мл спермы для того, чтобы прекратилось поступательное движение спермиев. Этот метод основан на действии хлористо- го натрия на защитную липопротеидную оболочку спермиев. Липопротеидная оболочка предохраняет сперматозоиды от воз- можных вредных воздействий окружающей среды, но в раство- ре хлористого натра эта оболочка набухает, разрушается, а то и вовсе сползает, что приводит их к гибели. Чем более мощную липопротеидную оболочку имеют спермии, тем больше должно быть разбавление и время воздействия раствором хлористого натра, чтобы все они потеряли поступательное движение. Стой- кость липопротеидной оболочки зависит от зрелости спермиев, от режима использования хряков, их кормления и содержания. Показатель резистентности очень важен, так как он связан с живучестью спермы и отражает биологическую полноценность и оплодотворяющую способность спермиев. Для определения резистентности спермы хряка необходимо иметь следующие реактивы и приборы:

1. 1 %-ный раствор химически чистого хлористого натра, приготовленного обязательно на дистиллированной воде.

2. Химическую бюретку с краном или зажимом Мора ем- костью на 100–200 мл и штатив к ней.

3. Микропипетку емкостью 0,02 мл, применяемую обычно при определении гемоглобина в крови по методу Сали, или гра-

дуированную микропипетку емкостью до 0,1 мл с делениями по 0,01 мл.

4. Колбы Эрленмеера (плоскодонные) емкостью  150–200

мл.

 

5. Предметные стекла.

6. Микроскоп с объективом 20 и окуляром 15 или 10.

В колбу микропипеткой отмеряют 0,02 мл спермы и прили-

вают туда же из бюретки 1 %-ный раствор хлористого натра порциями по 5 мл. После каждой прибавки раствора производят перемешивание двумя-тремя кругообразными движениями кол- бы и быстро оценивают подвижность спермы под микроскопом при температуре 40–42°С в каплях, не покрытых покровным стеклом.

Так поступают до тех пор, пока в капле при просмотре под микроскопом будут видны только неподвижные или колеблю- щиеся на одном месте спермии. Вычисление резистентности производят по формуле

R V ,

n

где V – объем прилитого раствора хлористого натра, мл;

n – объем спермы, взятой для титрования (0,02 мл).

Для быстрого вычисления резистентности спермы хряков можно пользоваться специальной таблицей (табл. 27).

 

Таблица 27

Таблица для вычисления резистентности спермы хряков

Прибавлено раствора хлористого натрия, мл	Резистентность	Прибавлено раствора хлористого натрия, мл	Резистент- ность
5	250	80	4000
10	500	85	4250
15	750	90	4500
20	1000	95	4750
25	1250	100	5000
30	1500	110	5500
35	1750	120	6000
40	2000	130	6500

45	2250	140	7000
50	2500	150	7500
55	2750	160	8000
60	3000	170	8500
65	3250	180	9000
70	3500	190	9500
75	3750	200	10000

Хорошая сперма хряка имеет резистентность от 1000 до 2000. Сперма хряка, имеющая резистентность менее 500, не пригодна для искусственного осеменения свиноматок, так как при этом значительно снижается оплодотворяющая способ- ность спермиев. На резистентность спермы оказывают влияние условия кормления, содержания и режим полового использова- ния хряков.

 

Переживаемость спермы хряков

Наряду с резистентностью важным показателем качества спермы хряков является ее переживаемость (живучесть) вне ор- ганизма. Характеристику переживаемости дает вычисление аб- солютного показателя переживаемости. Для его определения берут две пробирки емкостью 5–10 мл, вливают в них по 1 мл свежевзятой спермы, добавляют к ним по 3 мл среды (ГХЦС) и оценивают разбавленную сперму на подвижность; затем закры- вают ее корковой пробкой и ставят на хранение в тех условиях, в которых принято хранить сперму хряка в данном хозяйстве. Подвижность спермы оценивают через равные промежутки времени. Продолжительность этих промежутков определяют в зависимости от жизнеспособности спермы, но с таким расче- том, чтобы сперму одного эякулята можно было исследовать не менее 8–10 раз с промежутками от 2 до 6 часов. Результаты ка- ждой проверки подвижности спермы записывают в специаль- ную таблицу (табл. 28).

После того как все сперматозоиды во всех пробирках по- гибнут и графа «а» в табл. 28 будет заполнена за все дни, вы- числяют абсолютный показатель переживаемость спермы у хряков, завезенных из других хозяйств, а также после измене- ния условий кормления, содержания и полового использования.

 

Таблица 28

 

Таблица ежедневных записей для определения абсолютного показателя переживае- мости

---

Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 341; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!