Спермы хряка при разных степенях разбавления
Дата Кличка или № производите-
ля
| № пробирки |
Степень разбавления спермы | Дата |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
S | ||||||||||
| Час |
|
|
|
|
|
|
|
|
| |||||||||||||
| Т1 | Т2 | Т3 | Т4 | Т5 | Т6 | Т7 | Т8 | Т9 | Т10 | |||||||||||||
| t1 | t2 | t3 | t4 | t5 | t6 | t7 | t8 | t9 | t1 | |||||||||||||
| а1 | а1 t1 | а2 | а2 t2 | а3 | а3 t3 | а4 | а4 t4 | а5 | а5 t5 | а6 | а6 t6 | а7 | а7 t7 | а8 | а8 t8 | а9 | а9 t9 | а10 | а10 t10 | |||
| 1 | Не раз- бавлен- ная | |||||||||||||||||||||
| 2 | 2 | |||||||||||||||||||||
| 3 | 3 | |||||||||||||||||||||
| 4 | 4 | |||||||||||||||||||||
| 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 6 | 6 | |||||||||||||||||||||
| 7 | 7 | |||||||||||||||||||||
| 8 | 8 | |||||||||||||||||||||
|
|
|
Более полную характеристику спермы хряков можно получить при определении абсолютного показателя переживаемости при различных степенях разбавления. Для определения абсолютного показателя переживаемости при различных степенях разбавления сперму хряка разбавляют в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 раз.
Для этого берут восемь сухих стерильных пробирок емко- стью 2 мл и нумеруют их. Во все пробирки, начиная со второй и до восьмой, наливают мерной пипеткой на 1,0 или 2,0 мл по 1,0 мл разбавителя. В первую (пустую) и вторую пробирки налива- ют по 1,0 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка служит контролем. Сперму во второй пробирке размешивают и перено- сят 1,0 мл из второй пробирки в третью, здесь снова сперму размешивают и из третьей пробирки, после размешивания 1,0 мл, выливают. После разбавления спермы во всех пробирках проводят оценку подвижности ее при 40–42°С.
|
|
|
Данные проверки записывают в специальную таблицу (табл. 28), закрывают все пробирки стерильными пробками, ставят в специальный штатив и хранят при 0°С в термосе. Под- вижность спермиев проверяют ежедневно 1–2 раза под микро- скопом. Для правильного определения переживаемости необхо- димо очень строго соблюдать режим охлаждения спермы до 0оС не ранее чем через 10–12 ч.
Абсолютный показатель переживаемость спермиев опреде- ляют по формуле (%)
S=at,
где S — абсолютный показатель выживаемости спермиев — знак суммы;
а — подвижность;
t — время, вычисленное по формуле
t=(Tn+1 – Tn-1)/2,
где Tn+1— время последующего определения подвижности;
Tn-1 — время предыдущего определения подвижности. После того как во всех пробирках сперма погибает, произ-
водят вычисление. Вначале определяют значение Т для каждого
дня нарастающим итогом и заносят данные в таблицу. Затем вычисляют t для каждого определения и записывают в соответ- ствующую графу таблицы. Время (t), когда al изменилось в а2, а2 – в а3 и т. д., вычисляют исходя из того, что это произошло в середине между временем первого и последующего за ним на- блюдения, поэтому разницу между временем последующего и предыдущего определения делят на 2. Затем умножают каждый показатель подвижности (а) на соответствующий показатель времени (t), после этого суммируют по горизонтали все at для каждой пробирки за все дни хранения в ней спермы. Сумма at представляет собой площадь, ограниченную координатами вре- мени, подвижности и кривой падения подвижности, т. е. абсо- лютный показатель переживаемоcти S. Это наиболее объектив- ный показатель качества спермы, так как в нем учтены не толь- ко подвижность спермиев, но и время.
|
|
|
Абсолютный показатель переживаемости спермы опреде- ляют один раз в квартал. Сперма хорошего качества должна иметь абсолютный показатель переживаемости при разбавле- нии в 2—8 раз не ниже 700.
В практических условиях чаще всего определяют продол- жительность переживаемости спермы вне организма в часах. Для этого разбавленную сперму проверяют на подвижность че- рез каждые 24 или 12 часов до тех пор, пока подвижность спер- миев будет ниже 6 баллов. Сперма хорошего качества должна иметь оценку не ниже 6 баллов через 72 часа.
Определение количества патологических форм сперми- ев. Дополнить качественную характеристику спермы хряка можно путем определения в каждом эякуляте числа живых, мертвых и патологических спермиев. Для этого готовят 1,7 %- ный раствор эозина натрия, приготовленного на 1 %-ном рас- творе хлорида натрия, то есть 1 г хлористого натра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, а затем добавляют 1,7 г водо- растворимого эозина.
|
|
|
На край предметного стекла помещают каплю спермы, ря- дом наносят пипеткой каплю краски. Затем обе капли размеши- вают концом пипетки и делают мазок на этом же стекле. Для
этого к внутреннему краю капли прижимают плотно другое по- кровное стекло с хорошо отшлифованным краем и быстро тянут за ним каплю до противоположного конца стекла. Каплю нельзя двигать впереди стекла, мазок должен быть тонким, для чего надо делать маленькие капли. Мазок подсушивают на воздухе и подсчитывают под микроскопом число окрасившихся (мертвых) сперматозоидов и неокрасившихся (живых) в каждом поле зре- ния, пока не насчитывают 500 спермиев. Затем вычисляют про- цент спермиев, имеющих патологические формы. Сперма, в ко- торой содержится больше 30 % патологических спермиев, не пригодна для осеменения.
Разбавление и хранение спермы
В придатках семенников спермии находятся в малоподвиж- ном состоянии. При эякуляции в общий спермовыносящий ка- нал выделяются секреты добавочных половых желез, которые создают условия для свободного движения сперматозоидов. Кроме того, секреты добавочных половых желез сдвигают рН в щелочную сторону, что активизирует движение спермиев в по- ловых путях самцов и самок при естественном спаривании. Функции секретов добавочных половых желез очень важны и многообразны. Однако установлено, что спермии не могут дол- го жить в естественной среде вне организма и быстро погибают. Таким образом, естественная среда спермы, являясь необхо- димым условием во время эякуляции, в то же время отрица- тельно действует на спермии вне организма. Это объясняется тем, что при естественных условиях спермии подвергаются действию естественной среды сравнительно короткое время. Так, при естественном спаривании сперма вливается в матку, секреты добавочных половых желез быстро разбавляются сек- ретом половых путей свиноматки, всасываются ее стенками, и срок действия их на спермии ограничен. Поэтому все попытки сохранять сперму хряка вне организма в неразбавленном виде не увенчались успехом. В лучшем случае удается сохранить не- разбавленную сперму в течение нескольких часов. Отрицатель-
ное действие секретов добавочных половых желез на спермии при хранении спермы в неразбавленном виде выражается в бы- стром набухании и сползании липопротеидной оболочки спер- мия, их склеивании (агглютинации) из-за потери электрическо- го заряда, снижения оплодотворяющей способности и ускоре- ния гибели.
Искусственное осеменение свиней, как и других видов сельскохозяйственных животных, стало высокоэффективным методом воспроизводства поголовья лишь после того, как были разработаны синтетические среды для разбавления и хранения спермы вне организма. Первые опыты по применению различ- ных жидкостей в качестве сред для разбавления спермы сель- скохозяйственных животных были проведены И.И. Ивановым в 1900 году, который в принципе доказал такую возможность.
В дальнейшем В.К. Милованым (1930–1932) были изучены метаболические особенности спермиев, что послужило основой для создания теории разбавления спермы синтетическими сре- дами.
Вначале в качестве разбавителей спермы хряка использова- лись солевые или сахаросолевые изотонические растворы. За- тем в состав синтетических сред стали вводить вещества, обла- дающие свойством буферности (фосфат, цитрат), предупреж- дающие температурный шок (желток куриного яйца) и гибель спермиев при замораживании (глицерин, этиленгликоль), уско- ряющие продвижение спермиев в половых путях самок и по- вышающие оплодотворяемость (муциназа), снижающие мик- робную загрязненность спермы (антибиотики и сульфанила- мидные препараты). Из вышеперечисленного видно, что синте- тические среды для разбавления спермы надо рассматривать не только как наполнители, увеличивающие объем, но и как фи- зиологически активные и защитные вещества. Сохранение жиз- неспособности спермиев вне организма основано на явлении анабиоза — обратимого неактивного состояния, при котором обменные процессы половых клеток замедляются или временно прекращаются.
Из всех известных в биологии способов перевода клеток, тканей или организмов в состояние анабиоза при хранении
спермы в практике наиболее часто применяют кислотный ана- биоз или анабиоз, вызываемый понижением температуры. При использовании нескольких факторов, снижающих обменные процессы в половых клетках, наблюдается усиление анабиоза (явление синергизма).
В исследованиях В.К. Милованова (1931–1932) было уста- новлено, что, кроме правильного подбора компонентов для при- готовления синтетических сред, важное значение имеет концен- трация этих веществ в растворе. Чем больше веществ растворе- но в синтетической среде, окружающей спермии, тем выше ее осмотическое давление. Необходимо, чтобы оно было равно осмотическому давлению внутри спермиев. Такая среда называ- ется изотонической. Если в среде давление меньше, чем в спер- миях, то ее называют гипотонической, а если выше – гиперто- нической.
Как гипотонические, так и гипертонические среды губи- тельно действуют на спермии. Осмотическое давление опреде- ляют измерением точки замерзания (депрессии) жидкости по сравнению с дистиллированной водой с помощью специального термометра Бекмана со шкалой, разделенной на тысячные доли градуса.
Наивысшая живучесть сперматозоидов вне организма сов- падает с изотонической величиной осмотического давления.
Для хранения спермы важно, чтобы осмотическое давление в ней не изменялось. Нарушения осмотического давления в раз- бавленной сперме могут происходить вследствие двух причин: она подсыхает (в незакрытом сосуде) или в него попадает вода (стенки спермоприемника запотели, имеется течь во внутренней трубке искусственной вагины).
Для установления оптимального состояния трех основных компонентов синтетической среды в 1947 г. В.К. Миловановым была предложена методика треугольного графика. С помощью этой методики устанавливают оптимальное соотношение ком- понентов среды путем определения наивысшей выживаемости спермы при всех возможных сочетаниях трех компонентов. Эта методика позволила разработать множество синтетических сред для разбавления спермы различных видов сельскохозяйствен- ных животных.
Первые рецепты синтетических сред для разбавления спер- мы хряков были разработаны в 1931–1932 гг. В.К. Миловано- вым. В дальнейшем В.К. Миловановым, Т.М. Козенко (1949), В.К. Миловановым, И.И. Соколовской (1957) разработаны син- тетические среды для разбавления и хранения спермы хряков при температуре близкой к 0°С. Авторы установили, что сперма хряков лучше сохраняется в подкисленной среде следующего состава: вода дистиллированная – 100 мл, глюкоза медицинская безводная – 5 г, натрий лимонно-кислый трехзамещенный пяти- водный нейтрализованный – 0,5 г (к 100 г натрия лимонно- кислого добавляют 3,5 г кристаллической лимонной кислоты), желток крупного яйца – 3–5 мл, пенициллин и стрептомицин – по 50 тыс. ед.
Разбавленную сперму хряков вышеприведенной средой хранили во флаконах в термосе с тающим льдом при темпера- туре близкой к нулю. Однако в дальнейшем В.К. Милованов и Т.М. Козенко установили, что сперма хряков лучше сохраняется при температуре 12°С, чем при нуле, так как спермии хряка очень чувствительны к быстрому охлаждению и погибают в ре- зультате температурного шока.
С.И. Сердюк, И.М. Величко (1965), Б.Н. Вельможный (1965) в результате исследований установили, что увеличение в средах количества желтка куриных яиц не повышает устойчивость спермиев хряка к температурному шоку. Однако авторы отме- чают, что по мере хранения разбавленной спермы хряков в син- тетической среде с желтком спермии приобретают определен- ную устойчивость к температурному шоку при резком сниже- нии ее с 39 до 9°С. В то же время при большом перепаде темпе- ратуры (35–37°С) подавляющее большинство спермиев сохра- няли чувствительность к температурному шоку даже через 8–10 часов после разбавления и хранения.
Значительные успехи по разбавлению и хранению спермы хряков были получены, когда в составе синтетических сред ста- ли применять хелатон. Впервые этот препарат в составе для разбавления спермы быков применил в Нидерландах Кок
(1957). Хелатон (трилон Б, селектон Б2, версен, ЭДТА) – это двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты:
[CH2N × (CH2COOH) × CH2COONa]2×2H2O;
молекулярная масса – 372,24.
В нашей стране впервые для разбавления и хранения спер- мы хряков при температуре около нуля применила среду с хела- тоном А.П. Волосевич (1962–1963). В дальнейшем С.И. Сердюк (1963–1964) разработал глюкозо-цитратно-хелато-желточную среду (ГЦХЖ-У), которая была испытана в лабораторных и ши- роких производственных условиях и применяется в настоящее время.
В состав ГЦХЖ-У среды для разбавления и хранения спер- мы хряков входят: вода дистиллированная – 100 мл, глюкоза медицинская безводная – 5 г, натрий лимонно-кислый трехза- мещенный пятиводный – 0,3 г, хелатон – 0,1 г, желток свежего куриного яйца – 4–5 мл. Приготовляют ее следующим образом.
В чистую стерильную стеклянную колбу отвешивают необ- ходимое количество глюкозы, добавляют дистиллированную воду и кипятят 2–3 мин. После охлаждения раствора до 35–40°С добавляют цитрат натрия, хелатон и желток куриного яйца. Свежевзятую сперму хряка после фильтрования и определения концентрации разбавляют приготовленной средой, которую до- бавляют медленно, слегка перемешивая разбавляемую сперму. Температура среды в момент разбавления спермы должна быть в пределах 28–30 градусов. Оптимальная степень разбавления спермы этой среды – от 1:2 до 1:7. После разбавления проверя- ют подвижность спермиев и разливают ее в стерильные поли- этиленовые флаконы. Сохраняют сперму при температуре 6– 10°С.
В 1963–1967 гг. Н.Т. Плишко разработал метод хранения спермы хряков при температуре 16–20°С с использованием спе- циальной глюкозо-хелато-цитратной среды (ГХЦ). Эта среда нашла широкое применение в практике искусственного осеме- нения свиней. По данным Н.Т. Плишко (1968), в сперме, раз- бавленной ГХЦ-средой, 60–70 % подвижных спермиев сохраня- ется до 4–5 суток и более. М.Т. Садовникова (1966) разработала
и предложила для разбавления и хранения спермы хряков без хладоагентов синтетическую среду следующего состава: вода дистиллированная – 1000 мл, глюкоза – 51 г, лимонно-кислый натрий трехзамещенный пятиводный – 1,8 г, хелатон – 1,6 г, би- карбонат натрия – 0,5 г.
В 1967 г. Н.Г. Балашов и М.В. Силаева разработали для раз- бавления и хранения спермы хряков при комнатной температуре глюкозо-хелато-цитратно-сульфатную (ГХЦС-8) среду.
В настоящее время инструкцией по искусственному осеме- нению свиней (1976), изданной МСХ СССР для применения в практике, рекомендуется две среды (табл. 29). Применение дру- гих сред разрешается только в порядке их производственной проверки.
Таблица 29
Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 438; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!