Принцип количественного определения активности ферментов. Единицы активности.
Обнаружение ферментов основано на их высокой специфичности. Ферменты обнаруживают по производимому ими действию, т.е. по факту протекания той реакции, которую катализирует данный фермент. Например, амилазу обнаруживают по реакции расщепления крахмала до глюкозы.
Критериями протекания ферментативной реакции могут быть:
- исчезновение субстрата реакции
- появление продуктов реакции
- изменение оптических свойств кофермента.
Так как концентрация ферментов в клетках очень низка, то определяют не их истинную концентрацию, а о количестве фермента судят косвенно, по активности фермента.
Активность ферментов оценивают по скорости ферментативной реакции, протекающей в оптимальных условиях (оптимум температуры, РН, избыточно высокая концентрация субстрата). В этих условиях скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (V= K3[F0]).
Единицы активности (количества) фермента
В клинической практике используют несколько единиц активности фермента.
1. Международная единица – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата за минуту при температуре 250 С.
2. Катал (в системе СИ) – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата за секунду.
3. Удельная активность – отношение активности фермента к массе белка фермента.
4. Молекулярная активность фермента показывает, сколько молекул субстрата превращается под действием 1 молекулы фермента.
|
|
|
Иммуноферментный анализ, принцип, возможности использования.
Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы.
Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически.
Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.
|
|
|
Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а так же с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые планшеты или полистироловые шарики.
Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза.
Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения ИФА. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного ИФА состоит из нескольких стадий.
Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела наз-тся первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело.
|
|
|
Стадия 2. После отмывки лунок от несвязавшихся субстанций в каждую лунку добавляются вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IgA, IgG, IgM). К этим вторичным антителам химически пришит активный фермент. такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич».
Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент. в результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны.
Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген-антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии 3 точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа 1-3 часа.
В клинико-диагностических лабораториях ИФА применяется для следующих целей:
|
|
|
- диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатита С и В, коревой краснухи, лямбиоза, микоплазмоза, описторхоза, сифилиса, уреаплазмоза, ВИЧ-инфекции.
- определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликолустимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин, определение цитокинов и др.
- диагностика ранних сроков беременности
- пренатальная диагностика пороков развития плода
- определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Са-125 (для яичников).
Билет 9
Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 1395; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!