Посев возбудителей лейшманиозов на питательную среду с последующим культивированием
Необходимые реактивы и оборудование для культивирования
Посуда химическая стеклянная: воронки, колбы мерные плоскодонные конические (25, 50, 100, 200, 1000 мл), цилиндры мерные (25, 100, 1000 мл), пастеровские пипетки (5 и 10 мл), пипетки Мора (30, 50 и 100 мл), пробирки 15-25 мл с крышками, предметные стекла
Химические реактивы (х.ч.): хлористый натрий, бактериологический агар, бактериологический пептон, вода дистиллированная
Говяжий экстракт
Среды питательные: среда 199 с солями Хенкса с глутамином, среда RPMI-1640 с глутамином
Кровь кролика или человека
Антибиотики: стрептомицин и пенициллин
Штативы для пробирок
Автоматический пипеточный дозатор
Микроскоп (монокуляр или бинокуляр) с осветителем, объективом 
40, окуляром 10
Холодильники бытовые или холодильные шкафы с морозильной камерой, обеспечивающей температуру от 0 до 8 °С
Термостат суховоздушный лабораторный, поддерживающий температуру в диапазоне 25-37 °С
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г
Водяная баня лабораторная с диапазоном температур от 15 до 60 °С
Стерилизатор паровой медицинский
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов
Приготовление питательной среды
Приготовление полужидкой среды
1) В мерной колбе на 200 мл перемешать все компоненты: 2,5 г бактериологического агара, 1 г бактериологического пептона, 0,5 г хлористого натрия, 0,3 г говяжьего экстракта, 100 мл дистиллированной воды. Приготовленную агарную основу стерилизовать автоклавированием, затем остудить до 50-45 °С.
|
|
|
2) На водяной бане нагреть питательную среду 199 с солями Хенкса с глутамином до 45-50 °С.
3) В новой колбе к 1 части теплой агарной основы добавить 7 частей теплой питательной среды, перемешать встряхиванием, придавая полужидкую консистенцию.
4) Добавить к этой смеси свежую, стерильно взятую, дефибринированную нормальную кровь кролика или человека в соотношении 1:10. Добавить пенициллин 200 Ед/мл и стрептомицин 200 мг/мл, тщательно перемешать встряхиванием.
5) Среду разлить в пробирки по 1,5-2,0 мл. Хранить при 4 °С до 3 месяцев.
Приготовление питательной среды NNN
1) В мерной колбе на 200 мл перемешать все компоненты: 1,4 г бактериологического агара, 0,6 г хлористого натрия и 90 мл дистиллированной воды.
2) Приготовленную агарную основу стерилизовать автоклавированием, затем остудить до 50-45 °С.
3) Добавить 15 мл стерильно взятой дефибринированной крови кролика или человека, перемешать, вращая колбу.
|
|
|
4) Разлить в пробирки по 2-4 мл, после этого пробирки в слегка наклонном положении охладить до застывания или в холодильнике (косой агар) и поместить в термостат с температурой 37 °С для контроля стерильности и получения конденсационной жидкости. Пробирки хранить при 4 °С до 3 месяцев.
5) Перед использованием для культивирования лейшманий в пробирки с застывшим агаром добавить 2-3 мл среды 199 с солями Хенкса с глутамином или среды RPMI-1640 с глутамином. Для подавления роста бактериальной флоры в жидкую питательную среду добавить антибиотики: пенициллин 200 Ед/мл и стрептомицин 200 мг/мл, тщательно перемешать встряхиванием; рН среды должен составлять 7,4-7,6.
Примечание. При выделении и культивировании возбудителя использовать одну из представленных питательных сред.
Выделение и культивирование возбудителя
1) Подготовить пробирки со средой: нагреть до комнатной температуры и подписать. При возможности в стерильных условиях добавить клеточный материал в пробирку: несколько капель пунктата костного мозга, лимфатического узла при висцеральном лейшманиозе; соскоб со стенок разреза края поражения при наличии язвы или папулы.
2) Пробирки поместить в термостат на 25 °С, в лабораторный журнал записывают имя пациента, материал для посева, дату посева, а также сведения о больном и иную необходимую информацию.
|
|
|
3) Через 5-10 дней культуру просмотреть. Результат считать положительным, если обнаруживаются промастиготы. В данном случае штамму дать наименование согласно международной классификации.
4) Если через 10-15 дней промастиготы не обнаруживаются, результат считать отрицательным.
5) Перевозка пробирок должна осуществляться с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортирования инфекционных материалов.
Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 245; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!