ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ 7 страница

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 14Следующая ⇒

Для регулирования гидростатического давления в межстенном пространстве вагины в момент эякуляции в стенке входного края ее цилиндра имеются отверстия разного диаметра, которые позволяют перейти избыточному объему воды или воздуха из внутренней полости в наружную.

Искусственные вагины для взятия спермы у производителей готовят за ночь до использования в такой последовательности: тщательно вымытую и высушенную резиновую камеру длиной 60 см (7) вкладывают в цилиндр 4 длиной 30 см, натягивают ее отвернутые концы на наружную поверхность цилиндра и крепят к нему резиновыми кольцами (5) рядом с патрубком (б). При этом со стороны входа в вагину образуется дополнительное наружное межстенное пространство (J), сообщающееся с внутренним посредством отверстий (2) в цилиндре через которые осуществляется свободный переход воды и воздуха из одной камеры в другую (рис. 15).

На противоположный от входного отверстия конец вагины надевают спермоприемник одноразового использования (6) и крепят с помощью прижимных резиновых колец (5). Используемый спермоприемник представляет собой коническую емкость, заканчивающуюся цилиндрической чехол-пробиркой (II), внутри которой находится отрезок трубчатой муфты (9), соединенный с ней двумя сварными швами (10). Изготовлен спермоприемник из полимерной пленки толщиной 120+20 микрон путем термической сварки по контуру.

Прикрепленный к вагине спермоприемник вкладывают внутрь ее корпуса, после чего зачехляют оба конца пергаментной бумагой и закрепляют кольцами из камеры. Подготовленные таким образом вагины автоклавир уют при избыточном давлении 0,25 атмосферы (105 °С) в течение 20 минут.

После автоклавирования со стороны, где закреплен спермоприемник, с вагины снимают защитный бумажный чехол, в межстенное пространство вливают 150 мл воды, а спермоприемник расправляют, что необходимо для испарения конденсата. В таком виде прибор помещают в термостат при температуре 40...42 °С, где и хранят до момента использования, обычно до утра.

Стеклянную посуду (флаконы, колбы, цилиндры и пр.) скрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют пу-гм автоклавирования при 1,5 атм. в течение 30 минут. Ложно стерилизовать ее также в сушильных шкафах при температуре 105 °С в течение 1 часа. Металлические инструменты кипятят в дистиллированной воде не менее 30 минут. Халаты, косынки, шапочки, полотенца, вату стерилизуют в автоклаве или гладят горячим утюгом перед их использованием. Изделия из полимерной пленки облучают ультрафиолетовыми лучами в течение 20 минут лампой ПРК-2 или БУВ-30...60 при расстоянии источника излучения от объекта 15...20 см.

При закупке новой партии резиновых камер последние необходимо проверить на отсутствие токсичности резины, из которой они изготовлены. Для этого резину нарезают мелкими кусочками и после тщательной мойки добавляют к свежеразбавленной сперме в количестве около 5 %, затем сперму проверяют на выживаемость при 38 °С. Контролем служит сперма без кусочков резины. Показатели выживаемости в опыте и контроле не должны иметь достоверной разницы.

ВЗЯТИЕ СПЕРМЫ У БЫКОВ

Взятие спермы является одним из основных технологических процессов искусственного осеменения. От правильности организации работы на этом этапе зависит эффективность дальнейшей деятельности предприятия.

Оператор по отбору эякулятов от быков должен быть не только хорошо натренированным специалистом, но и иметь достаточное представление об анатомо-физиологи-ческих процессах, протекающих в организме самца во время полового акта. При взятии спермы он должен работать в чистом халате и спецодежде. Перед взятием каждого эякулята дезинфицирует руки спиртом-ректификатом или пользуется одноразовыми полиэтиленовыми перчатками, обработанными ультрафиолетовыми лучами.

Непосредственно перед использованием в межстенное пространство искусственной вагины нагнетают воздух, контролируя степень наполнения через стенку спермопри-емника, снимают защитный чехол и смазывают стерильным разбавителем просвет входного отверстия вагины.

Для этого в описанный спермоприемник наливают стерильный желточно-цитратный разбавитель (без глицерина) и герметизируют. Свободный конец трубки с зажимом вводят в просвет искусственной вагины и орошают

входное отверстие двумя-тремя миллилитрами стерильного желточно-цитратного разбавителя (рис. 16).

Приготовленную искусственную вагину из термостата (t = .42±1 °С) передают через шлюз в манеж технику, который зачехляет спермоприемник утепленным чехлом. При низкой температуре на внутренней поверхности спермо-приемника иногда оседают капельки конденсата, попадающего в сперму после эякуляции, что может вызвать гипотонический шок спермиев. Поэтому температура в манеже должна быть 18...20 °С.

Перед взятием спермы быка стимулируют путем сдерживания в течение 1...1,5 минут или предоставления одной-двух холостых садок на чучело.

Во время садки быка на механическое чучело техник направляет конец полового члена производителя в искусственную вагину под углом ^ 45°.

После выделения производителем спермы искусственную вагину ориентируют в горизонтальное положение и герметизируют взятый эякулят в спермоприемнике по линии 8 (см. рис. 15) путем термической сварки с помощью прибора "Молния" (рис. 17) или специального устройства для герметизации спермо- и эмбриоприемников (рис. 18).

Затем по метке 7 (см. рис. 15) спермоприемник с эякулятом отрезают, прикрепляют к нему этикетку и передают через специальный шлюз в лабораторию, а использованную вагину помещают в ванну с подогретым до температуры 40...60 °С 3 % раствором кальцинированной соды. Спустя один-два часа вагину тщательно моют, прополаскивают проточной теплой водой, затем — дистиллированной, монтируют, стерилизуют, как указано выше, и помещают в термостат с температурой 42 °С.

ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ

К лабораторным помещениям для работы со спермой предъявляются повышенные требования по освещенности, кондиционированию воздуха при температуре 20 °С и относительной влажности — 80 %, а также по гигиене. Необходимо следить, чтобы в процессе технологической обработки сперма нигде не контактировала с окружающими предметами. За два-три часа до начала работы помещение лаборатории облучают с помощью бактерицидных ламп. Такое время необходимо для того, чтобы выветрились токсические продукты, образующиеся в воздухе помещения после его облучения ультрафиолетовыми лучами.

Каждый эякулят оценивают органолептически, визуально. Наличие в сперме крови, мочи, хлопьев гноя указывает на патологические процессы в системе органов размножения. Такая сперма к использованию не допускается.

Поступивший в лабораторию эякулят взвешивают на весах марки ВЛКТ-500 или Р-2-200 (рис. 19), которые снабжены механизмом компенсации тары. Перед началом работы на весы кладут эталонный пустой спермоприемник, отрезанный по метке 7 (см. рис. 15). Рукояткой механизма компенсации тары устанавливают нулевое деление шкалы. После этого взвешивают чистую массу эякулята (принимается, что 1 мл спермы весит 1 г). Если сперму разбавляют по таблицам, показания массы снимают с точностью до 0,1 г, если степень разбавления определяют с помощью программируемого микрокалькулятора, с точностью до 0,01 г.

Такой способ определения массы эякулята позволяет полностью избежать микробной контаминации и отличается наиболее высокой точностью.

Для определения активности и концентрации пробу спермы отбирают в чехол-пробирку, которая является концевой частью спермоприемника. При отборе проб стенки спермоприемника слегка сдавливают левой рукой, а большим и указательным пальцами правой сжимают один-два раза концевую часть чехол-пробирки, заполняя ее спермой. Чехол-пробирку с пробой спермы с помощью специальных стерильных ножниц (рис. 20) отделяют от спермоприемника на уровне второго сварного шва (см. рис. 15). При этом должен оставаться нетронутым внутренний наконечник, а чехол-пробирка иметь жесткое кольцо. После отделения чехол-пробирки наружную поверхность наконечника обрабатывают 96-градусным спиртом и зачехляют стерильным отрезком полиэтиленовой трубки, запаянной с одного конца. Затем спермоприемник с эякулятом фиксируют в прорезях специального штатива (рис. 21). Таким образом, при отборе пробы эякулят остается интактным.

Во входное отверстие чехол-пробирки в горизонтальном положении плотно вставляют заточенный на конус конец микропипетки и путем сдавливания пальцами стенок пробирки набирают 0,05 мл спермы для определения концентрации. На многих предприятиях микропипетки монтируются с резиновыми шлангами и ватными фильтрами, через которые насасывают ртом сперму в микропи-петку. При использовании Харьковской технологии эта

Установка включает простой микроскоп с темнополъ-ным конденсором, термостатирующий столик и фотоаппарат или фотонасадку. Наблюдаемая картинка может экспонироваться прямо на экран.

Этот метод и устройство рассмотрены и одобрены как стандарт для определения абсолютного количества живых спермиев в дозе замороженной спермы при международном обмене.

М. Адам, А. Хамелин, Р. Берж и М. Гоффо (1969) предложили метод и прибор для исследования жизнеспособности спермы путем регистрации диффузии когерентного излучения лазера, который позволяет довольно подробно охарактеризовать эякулят по концентрации, подвижности спермиев и другим параметрам.

А.А, Бегма и соавторы (1991), идя по этому пути, создали лазерно-компьютерный анализатор для оценки качества спермы (ЛКАОКС), представляющий собой доп-плеровский корреляционный спектрометр, основанный на регистрации рассеянного на спермиях лазерного света, анализируемого коррелятором, строящим функцию рассеянного света, содержащего информацию о скоростях, частоте вращения и доле подвижных клеток. При этом распечатываются сведения о средней скорости движения спермиев в эякуляте, частоте вращения, энергии популяции спермиев и их концентрации. Однако все эти методы позволяют получить лишь видимые фотограмметрические характеристики спермы, которые сильно зависят от многих факторов (температуры, рН, солевого состава среды и др.), что существенно искажает истину и усложняет приборную часть. Кроме того, принцип анализа микроскопической картинки суспензии спермиев не несет достаточной информации о внутренней структуре клеток, устойчивости к повреждающим факторам и оплодотворяемости.

В связи с этим многие авторы настойчиво ведут поиски более информативных методов оценки спермы.

В частности, нами (Осташко, Катков 1982; 1984; 1985) установлена тесная зависимость (г = 0,872 при Р<0,001) между электромеханической прочностью мембранного аппарата спермиев и их криорезистентностью. На основе этого факта разработан метод прогнозирования пригодности эякулятов к замораживанию путем предварительного их испытания на устойчивость к пробою мембраны импульсным электрическим полем высокой напряженности (ИЭПВН).

Отобранные по этому показателю эякуляты даже с низкой активностью оказались криорезистентными и со-

Обозначения: А,,, Д,, А, — активность свежей, замороженно-оттаянной и обработанной ИЭПВН спермы (баллов).

хранили высокую оплодотворяемость (табл. 14). В то же время некоторые эякуляты с хорошей подвижностью спермиев при наблюдении под микроскопом имели низкую криорезистентность и низкую устойчивость к воздействию ИЭПВН.

Для получения более глубоких характеристик морфологического состояния клеточной структуры с успехом может быть применена интерференционная микроскопия. В ши-ринг-системе (например, микроскоп МП1-5 польского производства) за счет введения двоякопреломляющей призмы Волластона и скрещенных поляризатора и анализатора изображения объектов раздваиваются и разница в яркости каждого из двух изображений зависит от концентрации веществ в клетке и ее толщины (рис. 23). Благодаря изложенному, интерференционный микроскоп позволяет определять количество сухой массы, показатель преломления, толщину клетки и концентрацию вещества в клетке. На этом принципе нами (Васильев и др., 1975) разработан дифференциальный метод определения сухой массы, количества ДНК и белков в головках спермиев на мазках спермы. При этом установлено, что наивысшую оплодотворяющую способность спермы имели быки, у которых сухая масса головок спермиев находилась в пределах 8,49-8,82 пг, количество ДНК-2,7...2,9 пг, а отношение ДНК/белок — 0,46...0,52. У быков с меньшими или боль-

шими значениями этих величин оплодотворяющая способность спермы снижалась. Таким образом, разработан метод, позволяющий вести селекцию быков по прогнозируемой оплодотворяемости их спермы на

Таблица 14. Физиологические показатели некоторых эякулятов с низкой начальной активностью

№	№ садки	Физиологические показатели			Оплодотворясмость
		А_С	А_з	А_е	Осеменено голов	Стельных после 1 осеменения	%	Р
1 2 3 4 5 6 7 8	1* 2 1 3** 2* 3* 2* 3**	8 5 6 8 8 5,5 8 6 8,0 5,6	4 3,5 4 4,5 4 3,5 4 4 4,1 3,8	4 4 4 4,5 4 4 4,5 4 4,3 4,0	52 46 106 140 127 119 120 144 439 415	36 32 72 94 78 74 70 88 287 261	69,2 69,6 67,9 61,1 61,4 62,2 58,3 57,6 63,3 62,9	>0,1 >0,1 >0,1 >0,1 >0,1
В целом * - контроль ** - опыт

основе объективных показателей.

В настоящее время нами разрабатывается компьютерный метод и устройство для всесторонней оценки качества эякулятов с прогнозированием криорезистентности и оплодотворяемости. В него заложен принцип дифференциального анализа различных сведений об эякуляте (концентрация спермиев, активность, скорость движения, интенсивность вращения, криорезистентность спермиев и др.) и получение интегрального показателя, коррелирующего с оплодотворяемостью.

При отборе пригодных для замораживания эякулятов обязательно учитываются данные оценки быка на его плодовитость. Целью первичной оценки спермы является, прежде всего, недопущение к производству низкокачественных эякулятов, сперма от которых попадая в хозяйства, может стать причиной ухудшения воспроизводства стада и больших экономических потерь. Всегда надо помнить, что эффективность искусственного осеменения не в количестве проданных племенными предприятиями спермодоз, а в степени улучшения воспроизводства в стадах и темпах увеличения продуктивности животных за счет проводимой племенными предприятиями селекционной работы.

ТЕХНОЛОГИЯ РАЗБАВЛЕНИЯ СПЕРМЫ

История разработки оптимальных композиций сред для разбавления клеточных суспензий с целью их криоконсер-вации включает ряд периодов, которые отражают динамику уровня теоретических достижений в области криобиологии.

Первые работы в этом направлении (Максимов, 1913; Бернштейн, Петропавловский, 1937; Rostand, 1946; Соколовская, 1947; Смирнов, 1949; Polge, Smith, Parkes, 1949) были посвящены открытию способности живой материи сохранять жизнеспособность в замороженном состоянии. При этом были открыты разные криопротекторы как проникающие в клетку (глицерин и полиолы), так и не проникающие (различные сахара и полимеры). Затем следует период подробного изучения механизмов криоповрежде-ния и криопротекции клеток и разработки технологий замораживания и длительного хранения клеточных суспен-

зий (спермы, крови, различных растительных и животных тканей и органов). Эти методики отличались созданием очень сложных композиций криопротекторных сред, замысловатых графиков снижения температуры и громоздких установок, приборов и аппаратов с электронным и даже компьютерным управлением (Adler, 1960; 1961; Bratton, Foote, Cruthers 1955; Erikson, Graham, 1959; Hafs Elliott, 1955; Jondet, 1964; 1968; Polge, Rowson, 1952; Ostashko, 1964; Sullivan, Mixner, 1963; Willett, Ohms, 1958 и многие другие).

Положение существенно упростилось после работ Н. Nagase, E.F. Graham, Т. Niwa (1964), Н. Nagase, Т. Niwa, S. Yama-shita, S. Irie (1964), которые доказали, что комбинация проникающих (глицерин) и непроникающих (лактоза, сахароза, рафиноза) криопротекторов позволяет существенно упростить применяемые среды и методику замораживания спермы и отказаться от сложной аппаратуры.

Был разработан метод замораживания спермы в открытых гранулах с использованием 7 % глицерина на 11 % растворе лактозы и 30 % желтка, который имел большой успех и широко применялся в животноводстве многих стран. Он не используется только из ветеринарных и санитарно-гигиенических соображений. Однако принципиальные его особенности стали основой для создания современных технологий криоконсервирования и длительного хранения спермы производителей различных видов животных и птиц.

Эти достижения были использованы при разработке сред для Харьковской технологии обработки спермы, которая описана ниже.

При работе по этой технологии используют свежевзятую сперму с активностью не ниже 7,0 баллов (70 % активных спермиев) из отобранных по интегральному показателю эякулятов, полученных от быков с плодовитостью не менее 50 %.

В качестве разбавителей используют среды № 1 и № 2 по рецептам:

Среда № 1

Раствор лактозы (11 %-ный С₁₂Н₂₂О₁₁Н₂О) или сахарозы (С₁₂Н₂₂О₁₁), мл 63,0

Желток куриного яйца, мл 30,0

Глицерин (С₃Н₃О₃), мл 7,0

Среда № 2

Лактоза С₁₂Н₂₂О₁₁Н₂О или сахароза С₁₂Н₂₂О₁₁, г 6,0

Натрий лимоннокислый, трехзамещенный, пятиводный Na₃C₆H₅O₇x5,5 H₂O, г 1,4

Глицерин С₃Н₃О₃, мл 5,0

Вода дистиллированная, мл 100,0

Яйца должны быть из хозяйств, благополучных по заразным заболеваниям, от здоровой с хорошим витаминным питанием птицы, диетические. Это требование в наше время выполнить очень трудно, ибо не просто отыскать хозяйство, благополучное по туберкулезу и салъмо-неллезу птиц. Особую опасность представляет наличие в желтке возбудителя туберкулеза птиц, который при искусственном осеменении попадает в матку животных Хотя микобактерии туберкулеза птичьего вида (Mycobacterium tuberculosis avium) и не вызывают у рогатого скота клинической формы туберкулеза, они являются активным аллергеном, могут размножаться и сенсибилизировать организм животного, вызывая устойчивую аллергическую настроенность. Это может быть причиной появления в стадах аллергических реакций при очередных туберкулинизациях и снижения эффективности ветеринарных профилактических мероприятий. Все препараты должны быть безвредными для спермиев, не иметь примесей токсичных веществ, запаха. Хранят их в герметически закрытых емкостях с этикеткой, обозначающей предприятие, выпустившее препарат, название и степень чистоты: чда — чистый для анализа или хч — химически чистый. Используемые ингредиенты должны отвечать требованиям Государственной фармакопеи и ГОСТам, быть проверенными на безвредность для спермиев.

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 253; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 678 9 10 11 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!