ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ 4 страница

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 14Следующая ⇒

Автор с аспирантами провел также исследования воздействия гидростатического давления на спермии. Установлено, что спермии быка, разбавленные желточно-гаицериновой средой, способны выдерживать повышение гидростатического давления вплоть до 2000 кг/см (Зорин, Скорняков, 1971).

В 1976 году нами исследовано влияние на клетку резких перепадов гидростатического давления и дросселирования клеточной суспензии. При этом образцы разбавленной спермы или суспензии эритроцитов объемом 0,25— 0,33 мл герметизировались в ампулки из полимерной пленки толщиной 60—140 микрометров. Ампулки помещали в специальный шприц, к поршню которого прилагалось давление в пределах 5...30 кг/см2 до момента разрыва оболочки ампулки и впрыскивания ее содержимого в пробирку. Таким образом, в момент разрыва оболочки приложенное к клеткам гидростатическое давление резко падало, а сама жидкость распылялась, что вызывало гибель 50...70 % спермиев и частичный гемолиз эритроцитов. Если же клетки были предварительно обработаны 20 % концентрацией яичного желтка, гемолиз вызвать не удавалось, а количество поврежденных спермиев снижалось в 2...3 раза. В этих экспериментах установлен факт увеличения механической прочности плазматической мембраны клеток за счет ее фортификации компонентами яичного желтка, а также защитное действие желтка при воздействии на эритроциты и спермии резких осмотических перепадов (Bogart, Mayer, 1950; Осташко, 1963).

Нами совместно с А.В. Марющенко исследована устойчивость нативньгх и фортифицированных эритроцитов барана к воздействию ультразвука и у-лучей. При этом установлено, что устойчивость эритроцитов к названным выше физическим факторам существенно возрастает после фортификации их плазматической мембраны компонентами куриного желтка (таблицы 7 и 8).

Предлагаемая нами модель механизма фортификации находится в полном согласии с современным уровнем развития физической химии лигшдных растворов и мем-бранологии. Как известно, молекулы липидов и фосфоли-дидов, из которых состоит цитоплазматическая мембрана и которые входят в состав желтка куриного яйца (сфингомиелин, лецитин, фосфатидилхолин и др.), имеют общий план строения: длинные гидрофобные "хвосты", состоящие из углеводородных остатков, и прикрепленные к ним полярные "головки", в состав которых входят заряженные остатки фосфорной кислоты, аминов и др. Такое строение молекул липидов объясняет формирование двухслойной лшшдной структуры мембранных систем клетки, в которой гидрофобные "хвосты" углеводородных остатков формируют внутренность мембран, а на поверхность выходят полярные "головки", контактирующие с окружающей средой и протоплазмой. Кроме того, цитоплазматические мембраны содержат большой процент холестерина.

Исходя из общего плана строения молекул липидов можно объяснить механизм адсорбции этих веществ на поверхности мембраны. Водно-солевые растворы липидов имеют ламеллярную или мицеллярную структуру, которая характеризуется минимальной площадью соприкосновения гидрофобных частей молекул с водой и, таким образом, наименьшей свободной энергией системы. При возрастании концентрации липидов (^ до 50 %) в присутствии заряженных молекул белков наблюдается полислойное строение липидных растворов, когда раствор представляет набор бислойных липидных пленок, пространство между которыми, возможно, заполнено молекулами белка и растворителем.

Как указывают Э. Рис и М. Стернберг (1988), к фосфорной группе фосфолипидов часто присоединяется азотсодержащее основание, вследствие чего формируется полярная головка с двойным зарядом (+ -), которая при физиологических значениях рН может быть электрически нейтральной. Молекулы таких соединений (фосфорил-холин, фосфорилсерин, фосфорилэтаноламин и т.п.) имеют Дипольный момент. Наличие четко выраженного диполь-ного момента в молекуле липидов и электрического заряда на мембране клетки позволяет предположить значительное участие в эффекте фортификации мембран электростатических взаимодействий, в которых клеточная мембрана играет роль заряженного центра, где адсорбируются молекулы липидов раствора (рис. 4).

Таблица 7. Влияние интенсивности ультразвука и концентрации желтка куриного яйца на время жизни эритроцитов телки

Концентрация желтка куриного

яйца, %

Вреия жизни эритроцитов при интенсивности ультразвука в дозах, ч

М_общ.

0,6 w/см³

0,8 w/см³

1 w/см³

0 5 10 15 20 М_общ.¹

163 283 384 393 417 295

206 288 302 360 441 97,8

177 220 297 331 379 249

182 263 327 361 412

Таблица 8. Влияние интенсивности γ-излучення и концентрации желтка кури-ного яйца на время жизни эритроцитов телки

Концентрация желтка куриного яйца, %	Вреия жизни эритроцитов при их у-облучснии в дозах, ч			М_{общ. 2}
Концентрация желтка куриного яйца, %	13300 рад	52600 рад	71000 рад	М_{общ. 2}
0 5 10 15 20 М_общ.¹	84,6 109,2 144,0 129,6 154,2 134,3	76,2 94,8 108,0 140,0 156,7 125,0	51,0 57,6 63,0 67,8 70,2 79,2	70,6 87,26 105,0 112,6 127,0

Следовательно, гидрофильно-гидрофобное и кулонов-ское взаимодействия в системе "клеточная взвесь — водно-солевой раствор липидов" приводят к перераспределению молекул липидов между раствором и клеточной мембраной, таким образом, что часть липидных молекул адсорбируется на поверхности клетки и вся система приходит в более устойчивое энергетическое состояние с меньшим значением свободной энергии. Следует отметить, что адсорбция липидов на мембране должна носить динамический характер, в результате которого может установиться равновесие между присоединением молекул к защитному слою и их десорбцией, и количественное отношение липидов, находящихся на мембране и в растворе, будет подчиняться Больцмановскому распределению.

Исходя из предложенного механизма фортификации мембран можно предположить рад свойств липидного защитного слоя. Во-первых, толщина липидного слоя будет возрастать дискретно на величину, равную толщине одного оислоя, т. е. и с окружающим клетку раствором, и с поверхностью мембраны клетки молекулы липидов соприкасаются полярными "головками". Так как длина таких молекул колеблется в пределах 25...35 А, толщина защитного слоя будет увеличиваться при образовании еще одного адсорбирующего слоя на 40...60 А (с учетом взаимодействия «хвостов»).

Во-вторых, из дальнодействия электрических сил следует возможность образования нескольких би-слойных адсорбционных сдоев на поверхности мембраны, т.е. значительное (в несколько раз) утолщение мембраны при возрастании концентрации липидов в растворе. Следует отметить, что упорядоченность адсорбции с увеличением количества слоев будет ухудшаться. Вследствие экранировки заряда клетки гфедыдущими слоями упорядочивающее его значение будет снижаться, возрастет разрыхленность

последующих слоев и молекулы липидов будут занимать большую площадь, чем в более глубоких слоях; степень свободы их с клеткой возрастет и они будут легче переходить в раствор. Другими словами, энергия связи с поверхностью клетки каждого последующего слоя будет ниже, чем предыдущего, что приведет в конце концов к эффекту насыщения, когда толщина мембраны уже не будет возрастать несмотря на дальнейшее увеличение концентрации липидов в окружающем растворе.

Таким образом, на основании изложенного в настоящем описании и в цитируемых работах материала мы заключили, что обработка клеток яичным желтком или приготовленными из него препаратами, содержащими нейтральные и полярные липиды, сообщает повышенную или полную устойчивость к следующим повреждающим факторам: к резким температурным, осмотическим и гидростатическим перепадам, замораживанию, к облучению ультразвуком и у-лучами, к цитолитическому действию специфических гипериммунных сывороток и других гемо-литиков. Причем, это защитное действие выявлено на спермиях быков, баранов, хряков, индюков, а также на эритроцитах крупного рогатого скота, баранов, кроликов и человека. Все изложенные экспериментальные данные позволили заключить, что изученные лигшдные соединения обладают специфическим защитным свойством относительно мембранного аппарата фортифицируемых клеток и способны сообщить им неспецифическую устойчивость к

различным повреждающим агентам, местом приложения которых являются структурные элементы мембраны.

Суть механизма фортификации сводится к взаимной адсорбции липидов окружающей клетку среды с компонентами цитоплазматической мембраны за счет сил полярных и гидрофобных взаимодействий. При этом на поверхности клетки образуется дополнительная структура, сообщающая плазматической мембране дополнительную механическую прочность и изолирующая ее от соприкосновения с вредоносными агентами. Высказано предположение, что в процессе фортификации липидные фортифи-канты образуют не сплошной слой, а покрывают только липофильные участки цитоплазматической мембраны и поэтому их действие распространяется только на эти участки, благодаря чему обменные процессы между клеткой и окружающей средой не угнетаются, что свидетельствует о локализации пор на обладающих гидрофильными свойствами участках мембраны. Можно предположить: в случае участия в процессе фортификации полярных липидов, последние могут фортифицировать как гидрофобные, так и гидрофильные структуры цитоплазматической мембраны, воздействуя соответственно гидрофобными или гидрофильными элементами своих молекул. -

При такой интерпретации механизма фортификации поры должны локализоваться в участках мембраны, расположенных на стыках гидрофобных и гидрофильных элементов молекулы фосфолипидных соединений. Характер механизма взаимодействия липидов с липофильными элементами мембранного аппарата клеточной поверхности и конечный его результат позволяют отнести этот эффект к явлениям неспецифического действия, т.е. он проявляется не только по отношению к эритроцитам, но также и к другим клеткам и одноклеточным организмам и, с другой стороны, не только по отношению к агентам иммунной этиологии, но и к другим — механическим, электромеханическим, температурным, осмотическим, химическим, лучевым, ферментным и т. п. То есть, описанный эффект является биологической закономерностью.

Установление этой объективно существующей закономерности вносит коренные изменения в уровень научного познания о характере и последствиях взаимодействия цитоплазматической мембраны с окружающими веществами, в частности с лигшдными соединениями.

Эти теоретические данные могут быть использованы:

— в области науки — для развития нового направления в цитологии, изучающего закономерности строения и взаимодействия структурных элементов цитоплазматической мембраны с компонентами окружающей среды химической, физической, иммунологической природы;

— для углубленной проработки вопросов теории криобиологии, радиологии и иммунологии в связи с фортификацией клеточных мембран самыми различными фортифи-кантами естественной природы;

__для развития нового направления в области органического синтеза искусственных фортификантов с заведомо заданными свойствами;

— для развития теории проницаемости мембран и переноса веществ в системе "клетка — среда";

— для исследования механизмов иммунной несовместимости клеток при трансплантациях и т.д.;

— в прикладной медицине и ветеринарии — для разработки способов предотвращения или прекращения развития гемолитического синдрома и цитолитических процессов при различных заболеваниях и токсикозах;

— в биологии — для разработки искусственных сред и способов защиты клеток и одноклеточных организмов, эмбрионов и т.д. от различного рода повреждающих факторов.

На основе теории фортификации разработаны и апробированы: способ консервирования спермы животных (Осташко, Павленко, 1974), внедренный уже в широкую практику как элемент Харьковской технологии криокон-сервации спермы производителей, среда для криоконсер-вации спермы (Осташко, Павленко, Павленко, 1978), способ приготовления среды для разбавления спермы производителей (Осташко, Северин, Величко, Горенко, Ма-рющенко, Столяров, 1984), которые описаны ниже.

На основе изложенной теории создан способ фортификации мембран спермиев моноэтаноламином (Закарян, 1989). Этот автор установил, что введение в разбавитель для спермы быков моноэтаноламин-хлорида способствует снижению интенсивности разрушения мембранного аппарата спермиев. Моноэтаноламин является фрагментом молекулы фосфолипидов, участвующих в фортификации мембранного аппарата. При этом удалось предотвратить снижение активности спермиев на 0,1...0,2 балла и сохранить на 10...12 % больше спермиев с неповрежденной ак-росомой после замораживания.

Оплодотворяющая способность замороженной спермы быков, заготовленной при использовании моноэтанолами-на, оказалась на 18,4...10,9 % выше контрольной замороженной без моноэтаноламин-хлорида. Полученная в опытах разница была подтверждена при производственной проверке в широком опыте.

3 33

Наконец, новая теория позволила разработать метод лечения гемолитической болезни новорожденных путем фортификации плазматической мембраны эритроцитов созданным нами липосомальным препаратом — амифос-фодилом, включающим фосфотидилэтаноламин (кефалин), фосфатидилхолин (лецитин), сфингомиелин и холестерин (Гень, Осташко, Дибиров, Иванова, 1983). Фортификация эритроцитов этим препаратом существенно ускоряла выздоровление новорожденных детей-гемолитиков (Гень 1988).

Препарат рекомендован фармакологическим советом для клинических испытаний. Разработан метод диагностики патологического состояния эритроцитов (Осташко, Гржценко, Гень, Катков, 1985).

Таким образом, уже можно говорить о подтверждении достоверности теории фортификации мембранного аппарата клеток практикой прикладной биотехнологии и медицины.

При создании новой технологии работы племенных предприятий были изучены также источники контаминации спермы и полового тракта самок микробами и разработаны средства их устранения. Установлено, что все составляющие эякулят компоненты, каковыми являются секреты семенника и придаточных желез, в здоровом организме стерильны, т.е. не содержат микроорганизмов, и что микробная контаминация эякулята происходит за счет секретов мочеполового канала, препуция, а также нестерильных разбавителей, контакта с предметами окружающей среды — воздуха, инструментов для взятия спермы, поверхности тела животного и оператора и т.д.

Проведенные анатомо-физиологические исследования самцов и самок, а также биологические и биофизические исследования спермы позволили разработать комплекс методов, приемов, аппаратуры, устройств и инструментов, на основе которых создана новая технология криоконсерва-ции спермы, объединившая 30 изобретений и технологию искусственного оплодотворения самок путем трансплантации зародышей.

ТЕХНОЛОГИЯ РАБОТЫ ПЛЕМЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ

ОБЩИЕ ВОПРОСЫ

Основным технологическим процессом работы племенных предприятий является заготовка спермопродукции от быков, оцениваемых по качеству потомства, и реализация спермы от производителей, получивших категорию улучшателя. Украина располагает собственной технологией работы племенных предприятий, которая получила известность как Харьковская технология и широко используется в ряде государств.

Принципиальной особенностью этой технологии является то, что сперма от момента ее получения вплоть до введения в цервикальный канал самки не контактирует с внешней средой. Весь технологический процесс осуществляется по непрерывному поточному принципу в закрытой системе, он механизирован и автоматизирован. Конечный продукт выдается в виде облицованных в прозрачную полимерную оболочку замаркированных миниатюрных спермодоз объемом 0,2...0,25 мл.

Для осуществления технологии создан комплект аппаратуры, нового оборудования, устройств, материалов, сред и специальных инструментов.

Технологический процесс и оборудование могут быть применены при заготовке и использовании спермы всех видов животных и птиц, а также в микробиологической и Других отраслях промышленности для герметизации жидких препаратов и сред.

Основными преимуществами Харьковской технологии является простота и надежность осуществления технологического процесса, высокий уровень производительности труда, возможность получения свободной от микробной контаминации спермопродукции высокого биологического качества и высокой оплодотворяемое™ даже при использовании доз в пределах до 2,5 млн активных спермиев на одно осеменение; надежное сохранение технологического биологического и санитарного уровня спермы независимо от окружающей среды, возможность применения неразрушающего контроля качества спермиев в спермодозе и асептического способа осеменения самок; миниатюризация дозы, позволяющая экономить криогенную технику и хладоагенты. Технология универсальна, специальные инструменты обеспечивают возможность использования любого из применяемых способов искусственного осеменения визо-, мано- или ректоцервикалъного. Все это позволяет ускорить реализацию метода крупномасштабной селекции на основе оценки быков по качеству потомства.

В период широкого опыта на племенных предприятиях Украины, России и Монголии по новой технологии заморожено свыше 200 млн спермодоз, осеменено свыше 20 млн коров и телок. Оштодотворяемость законсервированной по новой технологии спермы была достоверно (на 5,7 %) выше по сравнению с другими технологиями, количество гинекологических заболеваний маточного поголовья в хозяйствах снизилось на 3...8%, а количество производителей на племенных предприятиях сократилось на 40...60 %.

Для внедрения новой технологии развиты смежные отрасли промышленности и налажен серийный выпуск модернизированной аппаратуры, одноразовых стерильных инструментов, долгохранящихся биологических сред и современной криогенной техники: сосудов Дьюара, стационарных и транспортных емкостей. Технология стала предметом экспорта в страны СНГ и дальнего зарубежья. Другие преимущества новой технологии по сравнению с зарубежными четко видны из таблицы 9.

Одним из важнейших технологических моментов при производстве молока является определение ранней стельности.

В настоящее время различными авторами разработаны способы ранней диагностики стельности на 10...19-й день после осеменения по регистрации уровня прогестерона в молоке. При этом наиболее приемлемым следует признать иммуноферментный метод по системе Elisa (Enzyme linked Lmmunosorbent assay), не требующий радиоактивных изотопов, сложного лабораторного оборудования и дающий высокую точность анализа: для животных с низким уровнем прогестерона — 100 % правильных показаний, с высоки^ уровнем — до 97 %.

Голландская фирма "Innovative Advies van der Mei", немецкая "Osnabrucker Herdbuch" и греческая "Biometria" предлагают для внедрения в хозяйствах свои варианты этого метода. Его применение уже в первый год позволяет сократить сервис-период в стаде на 30...40 дней и существенно снизить потери продукции за счет, своевременного принятия мер к неблагополучным животным, точного определения времени запуска коров и снижения яловости.

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 130; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!