Методи видобування ембріонів
Ефективність трансплантації ембріонів у значній мірі залежить від досконалості застосованого методу видобування їх з геніталій донора. Із сказаного вище можна зробити висновок, що на 4–5-ту добу основна кількість ембріонів у великої рогатої худоби попадає в ріг матки. Проте суперовуляція значно розтягується в часі і не всі ембріони одночасно з’являються у розі матки, частина з них може затримуватися в яйцепроводі до 8-го дня. Поступово ембріони переміщаються від верхівки рогу матки до його середньої і передньої частини.
Змінюється з часом і життєздатність ембріонів. У яйцепроводі практично всі вони бувають нормальними, проте в міру переміщення їх у матку і збільшення строку пе-
Розділ 7
ребування їх в умовах маткового середови-
4 5 3 2 6 1 7 9 10
ща (що не повністю відповідає віку усіх ембріонів), зростає кількість дегенерова-них ембріонів.
5 8 10
До середини 70-х років ембріони у корів видобували головно хірургічним методом, вимиваючи
Рис. 44. Гумовий катетер для нехірургічного вимивання ембріонів:
1 – гумова трубка; 2 – надувна кулька; 3 – отвори для введення та виведення рідини; 4 – гумова “заглушка”; 5 – сталевий стилет; 6, 7 – надувний канал; 8 – розширення
каналу; 9 – зовнішній кінець катетера із замковим вузлом (10).
їх з яйцепроводу чи рогу матки, залежно від часу вимивання. При цьому користу-валися одним з трьох доступів: розрізом
|
|
|
верхнього склепіння піхви з використанням спеціального приладу (ефеменатора) або без нього; лапаротомією по білій лінії живота із застосуванням наркозу; лапаротомією з боковим розрізом в ділянці голодної ямки під місцевою анестезією.
Із запропонованих для хірургічного видобування ембріонів інструментів найпри-датнішим виявився прилад Роуса і Даулінга, основою якого є гумовий катетер з на-дувною кулькою в кінцевій частині, привідним та відвідним каналом.
Згодомзапропоновано досконаліші металеві, гнучкі, пластмасові тагумові катетери. Найширшого розповсюдження набув двоканальний урологічний катетер Фолея, впро-світ якого перед застосуванням встановлюють гнучкий металевий стилет (рис. 44).
Для вимивання ембріонів користуються розчинами, які подібні за своїм складом до секрету матки (рідина Дюльбекко, середовища Ігла, Паркера, ТМС-199, Хема-10, Протасова, Менезо та ін.). Найбільш розповсюдженим є фосфатно-буферне сере-довище (ФБС) Дюльбекко, до 1 л якого перед застосуванням додають 40 г бичого альбуміну, 1,0 г глюкози, 0,036 г пірувату натрію та 100 тис. ОД пеніциліну (калієва сіль). Осмотичний тиск розчинів повинен бути 300 міліосмоль, рН 7,2–7,6.
|
|
|
Хірургічне видобування ембріонів з рогів матки шляхом лапаротомії по білій лінії. Витримують тварину два дні на голодній дієті, вводять їй внутрішньом’язово для заспокоєння ромпун чи комбелен. Фіксують на операційному столі в спинному положенні і проводять операцію під загальним наркозом. Підготувавши операційне поле, розрізають черевну стінку по білій лінії довжиною 15–20 см спереду молочної залози, виводять назовні один ріг матки з яйцепроводом і яєчником і підраховують в ньому кількість жовтих тіл. Фіксують тіло матки в раневому отворі, проколюють стін-ку рога матки біля біфуркації гострим гемостатичним пінцетом і вводять через утво-
Трансплантація ембріонів
рений отвір стерильний катетер Фолея з надувною кулькою, нагнітають в неї повітря і приступають до вимивання ембріонів матковим чи матково-трубним методом. В пер-шому випадку проколюють верхівку рога матки тупою голкою з оливою для введення промивної рідини і вводять у просвіт рога порційно 120–140 мл рідини Дюльбекко. Збирають промивну рідину через катетер Фолея в стерильну посудину. Аналогічно чинять з другим рогом матки.
При матково-трубному промиванні (застосовується на 3–5-й день після осіменін-ня) тупу голку з еластичним шлангом вводять в ампульну частину яйцепроводу і про-мивають так же.
|
|
|
Закінчивши промивання, опускають матку на своє місце, перевіряють правиль-ність розміщення її рогів, зрошують черевну порожнину фізіологічним розчином, впорскують у неї 1 млн ОД пеніциліну та стрептоміцину, розчинених в 20 мл новока-їну. Накладають кетгутні шви на очеревину, м’язи разом з підшкірною клітковиною, припудрюють поверхню рани порошком трициліну, накладають шовковий шов на шкіру, обробляють її 10 %-ним розчином йоду і обробляють клейовим аерозолем.
Хірургічне видобування ембріонів з рогу матки через лапаротомію в області голодної ямки (справа чи зліва). Даний методзначно простіший, менш трудомісткий і може проводитися під місцевою анестезією. Премедикація у даному випадку вклю-чає внутрішньом’язове введення ромпуна, епідуральну ін’єкцію новокаїну, паралюм-бальну та інфільтраційну анестезію 20 %-ним розчином новокаїну по лінії розрізу.
Фіксують тварину в станку,готують операційне поле іроблять вертикальний розріз шкіри, підшкірної клітковини та м’язового шару довжиною 15 см на віддалі 8 см спе-реду лінії колінного суглоба між зовнішнім горбом клубової кістки і заднім краєм ре-бра, на 10 см нижче поперечно-реберних відростків поперекових хребців. Підтягують гемостатичним пінцетомочеревину, розрізають її ножицями, розширюють розріз паль-цями і вводять рукувчеревну порожнину. Захоплюють великим тавказівним пальцями один ріг матки, підтягують його у просвіт розрізу, підраховують кількість жовтих тіл та проводять вимивання ембріонів спочатку з одного, а тоді з другого рога матки, як описано вище. Завершують операції так же, як при лапаротомії по білій лінії живота.
|
|
|
Кращих результатів досягають при вимиванні ембріонів з рога матки з боку роз-різу, оскільки до протилежного рога важко добратися.
Після операції залишають тварину під наглядом протягом двох тижнів, після чого знімають шви.
Хірургічний метод видобування ембріонів через розріз верхнього склепіння піхви (трансвагінальний метод). Фіксують тварину в станку і підраховують (рек-тально) кількість жовтих тіл у кожному яєчнику, наводять туалет перинеальної об-ласті, проводять епідуральну анестезію, забинтовують корінь хвоста, відводять його набік і зрошують внутрішню поверхню піхви 2 %-ним розчином діоциду.
Старанно миють і обробляють руки, беруть скальпель, затискають його між скла-деними конусом пальцями і вводять руку в піхву. Роблять з одного боку шийки матки дорзоназальний розріз склепіння піхви довжиною 2–3 см. Виймають з піхви скаль-
Розділ 7
пель, вводять через розріз в черевну порожнину спо-чатку два пальці, потім ре-шту і тоді цілу руку, спеці-ально підготованою тупою голкою (діаметром 1–2 мм) проколюють біля біфуркації іпсілатеральний ріг матки
Рис. 45. Схема нехірургічного вимивання ембріонів.
(що з’єднаний з яєчником, в якому виявлені жовті тіла) і вводять через утворений отвір кінець катетера з на-дувною кулькою для вими-вання ембріонів. Нагніта-ють в кульку 7–10 см3 пові-тря і за допомогою шприца
вливають в ріг матки теплу (37 °С) промивну рідину і відсмоктують її назад. Вимивання ембріонів з геніталій вбитих тварин виявляється ефективним, якщо
після забою пройшло не більше 2–2,5 годин. Нехірургічнедобуванняембріонів.
Хірургічні методи добування ембріонів складні та трудомісткі; їх можна застосо-вувати у однієї тварини не більше трьох раз. Тому в практичних умовах звичайно ко-ристуються нехірургічним методом, що базується на введенні в матку приладу через закриту шийку матки. Метод можна застосовувати безпосередньо на фермі, на 7–8-й день після осіменіння. Голодна витримка тварин не обов’язкова.
При цьому користуються металевими гнучкими, пластмасовими, латексними, гу-мовими двоканальними чи триканальними катетерами. Особливе значення тут має техніка “м’якого” проходження інструментом шийки матки.
Робота виконується групою з трьох чоловік: оператор і два помічники. Заводять ко-рову в манеж, фіксують її встанку,звільняють пряму кишку від калових мас, визначають стан статевих органів та кількість жовтих тіл у кожному яєчнику. Правда, яєчники важко пальпуються і точно встановити кількість жовтих тіл, без відповідного досвіду, не легко.
Наводять туалет перинеальної області і роблять епідуральну анестезію, вводячи 5 мл 2 %-го розчину новокаїну, ксилокаїну чи медокаїну або 8–10 мл 2 %-го розчину прокаїну. Для зняття напруження кишки можна ввести внутрішньом’язово 0,5–0,7 мл ромпуна чи 0,7–1,0 мл комбелену.
Беруть чистий стерильний катетер, вставляють у його простір металевій стилет і вводять його в піхву в напрямку шийки матки. Ліву руку вводять у пряму кишку, про-мацують нею катетер, скеровують його кінець в устя шийки матки, захоплюють її ру-кою і натягують обережно на катетер. Після цього просовують катетер на всю глибину в іпсілатеральний ріг матки, виймаючи обережно стилет. Помічник нагнітає в кульку
Трансплантація ембріонів
10–15 см3 повітря і, з’єднавши зовнішній кінець катетера з наповненим промивною рідиною 50-мілілітровим шприцом, вводить його вмістиме у порожнину рога мат-ки і відсмоктує назад. Оператор при цьому легко масажує ріг матки і дещо підіймає його верхівку. Зливши обережно промивну рідину по стінці в стерильний циліндр чи мензурку і, накривши її стерильною фольгою, помічник знову набирає свіжу порцію розчину в шприц і промиває ним ріг матки і т. д.
На один ріг матки витрачають до 500 мл рідини. При цьому слід уникати зворот-ного введення відсмоктаної рідини та попадання в неї крові. Введена кількість ріди-ни повинна відповідати кількості відсмоктаної. Якщо промивна рідина втрачається і проходить мимо кульки, то збільшують в ній тиск повітря, проте при надмірному тиску повітря можуть виникати розриви слизової оболонки.
Закінчивши промивання одногорога матки, випускають з кульки повітря івводять в ріг суміш антибіотиків, розчинених у 20 мл 0,5 %-го розчину новокаїну. Після цього беруть інший стерильний катетер, вводять його в такій же послідовності в другий ріг матки і промивають його.
Збирають промивну рідину в стерильний мірний циліндр чи ділильну лійку і на-кривають фольгою.
Є повідомлення (В. та Л. Мадісон), що від однієї корови вимили 37 ембріонів, з яких 26 виявилися придатними для пересаджування та заморожування.
У телиць внаслідок щільного закривання шийки матки після охоти нехірургічне вимивання ембріонів буває важким, особливо, коли для вимивання ембріонів засто-совують товстий французький катетер з телескопічним зондом та системою проточ-них шлангів. В подібних випадках перед введенням катетера попередньо розширюють цервікальний канал за допомогою металевого чи скляногодилятатора. Промивна ріди-на при цьому самопливом поступає у матку і повертається у збірну посудину. Під час промивання матки будь-яким методомпотрібно постійно контролювати положення ка-тетера, який скороченнями міометрію поступово переміщається з рога в тіло матки.
У наведеній таблиці зроблено порівняння хірургічного і нехірургічного методів вимивання ембріонів (за А. Брендом).
До головних невдач, що трапляються при вимиванні ембріонів, можна віднести: Ø іноді не вдається пройти катетером цервікальний канал. У подібних випадках
застосовують сакральну анестезію, теплі зрошення шийки матки, ін’єкції аналогів ПГ-F2α, ханегіфу та ін.;
Ø важко виймається стилет з введеного катетера – необхідно підібрати до нього інший стилет;
Ø при застосуванні малих катетерів у телиць іноді його наконечник закупорю-ється слизом, що перешкоджає витіканню промивної рідини;
Ø при надмірному чи швидкому наповнені кульки повітрям можуть спостеріга-тися проколи чи розриви ендометрію, внаслідок чого промивна рідина проникає під нього і не витікає;
Розділ 7
Ø при інтенсивному промиванні рогів матки, стисканні їх руками може також пошкоджуватися слизова оболонка матки і в промивній рідині з’являється кров.
Таблиця 13 Порівняльна оцінка методів вимивання ембріонів
| Хірургічні | методиНехірургічні |
| Переваги Донор нерухомий. Донор відносно нерухомий. Забезпечення стерильності. Можливість пересаджування в умовах ферми. Безпосереднє маніпулювання з маткою. Не потрібне голодне витримування. Точна оцінка стану яєчників. Менші затрати часу. Потрібна невелика кількість промивної Немає хірургічного ризику. рідини. Недоліки | |
| Утворення спайок. Ризиковане застосування загального наркозу. Складності застосування методу у лактуючих тварин. Необхідне складне хірургічне обладнання. Потрібне голодне витримування тварин. | Необхідна висока техніка маніпулювання з рогами матки. Потрібно біля 500 мл промивної рідини на один ріг. Важко забезпечити стерильність. Іноді неможливо пройти цервікальний канал. |
Мето
Вирішуючи питання про кратність використання донорів, виходять з того, що їх реакція на гормональні препарати не завжди буває однаковою. Лише, у незначної час-тини тварин рівень овуляції утримується на одному рівні, у других він поступово знижується, у третіх – має форму ввігнутої кривої, четверті – постійно реагують міні-мальним числом овуляцій і п’яті – взагалі не реагують. Все це слід враховувати.
Окремі автори (Н. П. Кирилова з співавторами) повідомляють, що із збільшенням числа овуляції знижується заплідненість яйцеклітин і зменшується кількість нормаль-них ембріонів. У однієї вибракованої голштинської корови з надоєм за п’яту лактацію 8 713 кг молока автори за 6 вимивань з інтервалом 60 днів отримали 84 ембріони, з яких лише 33 були придатними для пересаджування та заморожування.
Крісті з співробітниками у досліді на 14 донорах за 10 циклів суперовуляції отри-мали в середньому по 10,2 ембріони за одне вимивання, які розміщувались в порядку проведення дослідів таким чином: 14,25; 10,9; 11,5; 10,5; 11,4; 11,6; 10,0; 0; 7,0; 6,5; 8,2. Тобто поза всякою закономірністю.
Трансплантація ембріонів
7.7. Технологія роботи з ембріонами
Зібрану в скляний циліндр під час вимивання ембріонів промивну рідину накри-вають алюмінієвою фольгою, передають у стерильний бокс, де ставлять на півгоди-ни в термостат для відстоювання. Для уникнення забруднення промивної рідини та ембріонів у багатьох зарубіжних центрах всі маніпуляції з ембріонами проводять під ламінарною течією відфільтрованого повітря у спеціальних шафах, де низхідні течії стерильного повітря перешкоджають проникненню мікрофлори.
Після відстоювання промивної рідни відсмоктують за допомогою сифону її верх-ній шар, а залишених на дні 50–100 мл розливають обережно по 20–30 мл у чашки Петрі, дно яких для зручності розкреслено на квадрати, розміром 1 × 1 см, і досліджу-ють під стереоскопічним мікроскопом (МБС-9) чи бінокулярною лупою при 15–25-кратному збільшенні.
Досліджуючи уважно промивну рідину під мікроскопом, намагаються перш за все “виловити” в ній усі ембріони та незапліднені яйцеклітини і перенести їх у маленьку чашку Петрі для детальної оцінки і дальшої роботи з ними.
Оцінюючи стан кожного ембріона, звертають увагу на: відповідність стадії роз-витку ембріона його віку; форму прозо-
рої оболонки та її цілість; рівномірність дроблення бластомерів; стан цитоплазми; прозорість перивітелінового простору.
Біологічно повноцінні ембріони мають чітку кулясту форму, прозору гомогенну цитоплазму, непошкоджену прозору обо-лонку, однакового розміру бластомери з щільним міжклітинним комплексом. Емб-ріони, що містять різних розмірів бласто-мери з нечіткими клітинними мембранами та іншими ознаками дегенерації, вважа-ються неповноцінними.
Рис. 46. Ранні стадії розвитку ембріона ве-ликої рогатої худоби:
1) незапліднена яйцеклітина та спермій (ПО – прозора оболонка, Ж – жовткова оболонка, 1ПТ – перше напрямне тільце, С – спермій); 2) зигота, 1-й день розвитку (ПВП – перивітеліновий простір); 3) 2-й день, ембріон на стадії 2-х бластомерів (Б); 4) 2–3-й день, 4-клітинна стадія роз-витку ембріона; 5) 3–4-й день, 8-клітинна стадія; 6) 5–6-й день, морула; 7) 6–7-й день, рання бластоциста (ПБ – по-рожнина бластоцисти); 8) 7–8-й день, експандована блас-тоциста (Е – ембріобласт, Тр – трофобласт); 9) 8–9-й день, бластоциста на стадії вилуплення; 10) 9–11-й день, вилуплена бластоциста; 11) 12-й день, пізня бластоциста; 12) 14-й день, видовжений бластодермічний міхурець.
219
Розділ 7
Вище наводились основні риси ембріона на ранніх стадіях його розвитку. Ці риси слід чітко пам’ятати і по них оцінювати “вік” ембріона, його повноцінність. При ви-миванні ембріонів з яйцепроводів практично всі вони бувають на стадії ранньої мору-ли, тоді як при вимиванні ембріонів з рога матки більшість з них буває на стадії ран-ньої бластоцисти. Внаслідок деякої розтягнутості суперовуляції тут можуть зустріча-тися і морули, і пізні бластоцисти, і незапліднені яйцеклітини в стані дегенерації (зі зморщеною, нерівної форми цитоплазмою), і, нарешті, зародки неправильної форми, з порушеннями цілості прозорої оболонки, її розривами, розшаруваннями, стисненою порожниною, нерівномірним дробленням, порушеннями міжклітинних зв’язків, гра-нуляцією протоплазми. Відправною рискою при оцінюванні ембріонів є день циклу, на який проводиться вимивання, і типічні для даного “віку” риси ембріона.
Ембріони, що різко відстали у своєму розвитку, з вираженими ознаками асинхрон-ності дроблення бластомерів, їх дегенерації непридатні для трансплантації, тоді як ембріони з незначними морфологічними змінами вважаються умовно придатними.
Значно більші зміни спостерігаються у збережених у замороженому стані ембріо-нів, тому оцінка їх буває важчою.
Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за таки-ми показниками: життєздатні – ембріони, стадія розвитку яких співпадає з їх віком, що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені (ретардовані) – ембріо-ни, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку, ніж очікувалося в зв’язку з їх віком; вироджені (дегенеровані) – ембріони з різними ознаками дегенерації.
Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні; ембріони з незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю дегенерованих клітин.
М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки ембріонів за морфологічними ознаками.
Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і від при-живлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне – доступних для виробництва методів поки що немає.
В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій кількості по-живного середовища на 30–40 хв. в термостаті для діагностичного культивування.
Короткотермінове збереження та культивування ембріонів. Від видобування ембріонів у донорів до пересаджування їх реципієнту проходить звичайно не менше 3 годин. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів.
Для цього ембріон можна помістити в 0,5 мл середовища на годинниковому скель-ці, поставити його в стерильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтруваль-ним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.
Для більш тривалого зберігання ембріона (у відповідному середовищі в ампулах, поліхлорвінілових пайетах для осіменіння) засмоктують ембріон в пайету таким чи-ном, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1–1,5 см. Закри-вають кінці пайети стальними кульками чи поліетиленовими корками і поміщають в
Трансплантація ембріонів
термостат при 37 ºС чи під шаром стерильного вазелінового масла на годинниковому склі чи у пробірці.
В таких умовах біологічно повноцінні ембріони можуть зберігатися до 24–48 го-дин, але в практичних умовах культивування при 37 °С застосовують лише як виму-шений короткочасний захід.
В кінці культивування обов’язково перевіряють під мікроскопом життєздатність ембріонів.
Одним з прикладів успішного зберігання ембріонів при температурі тіла є досліди кембріджських вчених по пересаджуванню ембріонів овець у яйцепроводи кролиці, які дозволили здійснити ряд міжконтинентальних перевезень ембріонів з послідую-чою їх ретрансплантацією. Після хірургічного пересаджування таких ембріонів отри-мано нормальних нащадків.
Можна також зберігати ембріони при знижених плюсових температурах, що ви-кликають зворотне гальмування метаболічних процесів.
Кріоконсервування ембріонів. Ще в 1953 р. О. Сміт вперше вдалося заморозити ембріони кролика, проте для перенесення цих дослідів на сільськогосподарські тва-рини потрібно було біля 20 років.
Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є ран-ня бластоциста, овець і кіз – пізня морула чи рання бластоциста, свиней – бластоцис-та; краще переносять заморожування свіжі ембріони.
Заморожування та розморожування ембріонів може супроводжуватися кристалі-зацією води в бластомерах та концентрацією розчинених речовин у рідкій фазі. Ці два процеси можуть проявлятися одночасно, хоча кристалізація більш виражена при відносно швидкому, а осмотичні зміни – при повільному заморожуванні.
Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато складнішим від заморожування сперми, оскільки ембріони є багатоклітинними утвореннями. Тому дуже важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх захисту від температурних та осмотичних пошкоджень.
В процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в навколо-клітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість льоду, тоді як в решті розчину зростає концентрація солей.
Виникає таким чином різниця осмотичного тиску між позаклітинною та внутріш-ньо-клітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі клітинами води в позаклітинне середовище.
Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу середовища до-дають кріопротектори диметилсульфоксид (ДМСО) чи гліцерин, а щоб не допустити осмотичних зрушень – штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії. Проте саме введення до складу середовища з ембріонами кріопротектора, як і його видален-ня, може викликати осмотичні зрушення. Тому, це насичення (еквілібрацію) роблять поступово,поміщаючи ембріони на годинникових стеклах в чашках Петрі спочатку на 5–10-хв. у 0,25 М розчин ДМСО, тоді – в 0,5 М, 1,0 М і нарешті – 1,5 М розчин.
Розділ 7
В останньому розчині ембріони витримують 15–20 хвилин. Якщо кріопротектором служить гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10 хв. у 3,3 %-ий його розчин, тоді на 14 хв. у 6,6 %-ий і в кінці на 30 хв. у 10 %-ий розчин. Після розморожування ембріонів їх також відмивають від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріопротектора в менш концентровані розчини.
Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором їх розфасовують по пробірках, ампулах чи пайетах для заморожування, яке проводять одно- чи двоетапним методом, повільно чи швидко. В пайети ембріони поміщають в такій послідовності: середови-ще – повітря – середовище з ембріоном – повітря – середовище. Кожен стовпчик по-винен займати в пайеті біля 1–2 см довжини. Один край пайети закривають зволоже-ним корком.
Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін, за 4–5 ºС до початку льодоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину зернину льоду, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються ним поверхні рідини).
| , |
Розморожують ембріони в спиртовій бані – скляній циліндричній колбі з температу-рою –50 °С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і розморожують зі швид-кістю 4 °С/хв. до 10 °С, після чого переносять на 5 хв. у водяну баню з температурою 20 °С. Нарешті, переносять ембріони в середовище для видалення кріопротектора.
Швидке заморожування та розморожування ембріонів. Охолоджують ембрі-они у міні-пайетах – від 20 ºС до 7 ºС зі швидкістю 1 ºС/хв., викликають кристаліза-цію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 ºС/хв. лише до –30 ºС і переносять в рідкий азот. Розморожують ембріони у водяній бані з температурою 37 °С протягом 30 сек. зі швидкістю 3,0 °С/хв.
НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся УРСР запропонував свою технологію за-морожування ембріонів: свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. в 0,5 М розчин ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. в таке ж середовище з 1,3 М ДМСО, після чого, по 3–4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0,5 мл 1,0 М ДМСО на ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний апарат для охолодження і заморожування.
Заморожування ведуть за такою програмою: від 22–25 °С до 6 °С зі швидкістю 1 °С/хв., штучно збуджують кристалізацію середовища і заморожують від –7 °С до –40 °С зі швидкістю 0,3 °С/хв., від –40 °С до –60 º С – зі швидкістю 0,1 ºС/хв., після чого переносять пробірки з охолодженими до –60 °С ембріонами в рідкий азот.
Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у соломин-ках, які містять одночасно два середовища – для заморожування (рідина Дюльбекко з
Трансплантація ембріонів
10 %-им гліцерином і поміщеним в ній ембріоном) і середовище для розморожування (рідина Дюльбекко з 20 % фетальної сироватки і 0,5 М розчином сахарози). Після розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримають на 10–20 хв. при кімнатній температурі і пересаджують ембріон реципієнту.
При заморожуванні ембріонів необхідно суворо дотримуватися технології. За-морожування ембріонів дозволяє значно вдосконалити організацію трансплантації і відпадає потреба утримання великої кількості реципієнтів і термінового пересаджу-вання вимитих ембріонів. Замість цього можна створювати банки ембріонів, прово-дити трансплантацію розморожених ембріонів реципієнтам після спонтанної охоти, проводити їх експорт та імпорт.
Дата добавления: 2016-01-04; просмотров: 24; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!