Автоматическое секвенирование ДНК
В основе автоматического секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP (*). Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки.
Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке.
|
|
|
14.Конструирование делеций для секвенирования.Приготовление матриц для секвенирования ДНК
Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма, их используют для локализации (картирования) функционально значимых участков генов и кодируемых этими генами белков. Последовательное удаление участков ДНК на границах генов с помощью делеций оказалось плодотворным в обнаружении регуляторных элементов генов, исследовании их структурно- функциональных особенностей, взаимного расположения и влияния друг на друга.
Метод получения делеций любого размера разработан с использованием экзонуклеазы Bal31 для удаления нуклеотидов в окрестностях сайтов рестрикции (рис. II.16).
Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Bal31. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К "тупым" концам таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо посредством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки.
|
|
|
14.2. Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса.
Первые успехи в ферментативном секвениро-вании были достигнуты с природными одноцепочечными ДНК, такими как бактериофаги фХ17 и fl [Sanger et al., 1977a; 1973]. Значительные усилия, которые приходилось прикладывать экспериментаторам для получения одноцепочечных матриц ДНК, пригодных для секвенирования ферментативным методом, первое время сдерживали широкое распространение этого метода, поскольку время, затрачиваемое на их получение, являлось основной составляющей всего процесса. Так, в ранних экспериментах по секвенированию ДНК предлагалось клонирование представляющего интерес фрагмента в бактериофаге лямбда с последующим разделением цепей [Davies, 1982] путем весьма длительного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия с поли(U, G), известного достаточно давно [Szybalski et al., 1971]. Другим способом получения матриц для секвенирования, также основанном на делении цепей, но уже хроматографией, был путь клонирования фрагментов ДНК в специальном векторе рКН47, сконструированном на основе плазмиды pBR322, и содержащем поли(dA):поли(dT) дуплексный фрагмент протяженностью около 100 пн [Hayashi, 1980]. Это позволяло после денатурации плазмидной ДНК осуществлять достаточно эффективное разделение цепей клонированной вставки вместе с векторными последовательностями, одна из которых несла поли(dA)-, а другая - по-ли(dT)-участки на колонках с олиго(dT)- и олиго(dA)-целлюлозами соответственно.
|
|
|
Фаги f1, будучи не изометрическими, позволяют клонировать в них вставки чужеродной ДНК, однако их размер обычно не превышает 1 тпн ввиду нестабильности вставок большего размера. Созревание фаговых частиц сопровождается их выходом наружу в культуральную среду без лизиса бактериальной клетки. Поскольку ДНК в фаговых частицах представлена одиночной (+)-цепью, то и содержащаяся в рекомбинантных фагах вставка также будет одноцепочечной. Остается только собрать фаговые частицы и отделить от белка фаговую ДНК. После завершения этих процедур одноцепочечная матрица ДНК готова для секвенирования ферментативным методом. Детальное описание всего этого процесса изложено в многочисленных статьях [Messing et al., 1981; Messing, 1983; Sangeret al., 1980; Davies, 1982; Bankier, Barrell, 1983, 1989; Kristensen et al., 1987; Краев, 1988] и практических руководствах [Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989; Promega Guide, 1996]. Кроме этого, существует описание отдельных подходов, имеющих целью как-то усовершенствовать процедуры выращивания фага М13, выделения и очистки его одноцепочечной ДНК [Reddy, McKenney, 1996]. Довольно много статей посвящено автоматизации процесса выделения одноцепочечной ДНК фага М13 из большого числа фаговых бляшек, что имеет прямое отношение к автоматическим методам секвенирования ДНК и поэтому будет рассмотрено в соответствующем разделе.
|
|
|
15. Экспрессия белков E.coli.Оптимизация экспрессии белков с использованием регулируемых промоторов
Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов, используемых для продукции гетерологичных белков вследствие того, что она способна к быстрому росту до высоких концентраций на простых средах, ее генетика достаточно хорошо охарактеризована, доступен большой набор клонирующих и экспрессионных векторов и мутантных штаммов.Идеальный экспрессионный вектор должен обеспечивать высокий уровень синтеза продукта в случае индукции при минимально низком базовом уровне экспрессии, что необходимо, в первую очередь, при экспрессии продуктов, которые могут быть токсичны для клетки.Несмотря на это, большинство современных систем для синтеза гетерологичных белков в E. coli обладают относительно узким диапазоном регулирования. Так, например, диапазон регуляции синтеза продукта в коммерческой системе pQE фирмы Qiagen составляет всего 100-200 раз. Вследствие этого системы, обладающие низким базовым уровнем экспрессии, не позволяют достичь высокого уровня синтеза продукта при полной индукции, а системы с высоким максимальным уровнем имеют обычно и достаточно высокий базовый уровень экспрессии, что делает их мало пригодными для получения чужеродных полипептидных продуктов, которые могут быть токсичными для бактериальной клетки.
15.2.
Регуляция уровня синтеза целевого белка в существующих экспрессионных системах достигается за счет использования промоторов, уровень активности которых (т.е. количество актов инициации синтеза мРНК за единицу времени) может быть искусственно изменен, и/или путем изменения числа копий вектора, определяемого участком, который ответственен за репликацию.
А) Регулируемые промоторы
Большинство используемых промоторов для экспрессии генов в E. coli получены из грамм положительных бактерий и бактериофагов. Классическим примером регуляции экспрессии генов у прокариот в природе является лактозный оперон, поэтому именно его компоненты используются во многих регулируемых промоторах. Сам lac промотор, как и сходный с ним lacUV5, является достаточно слабым и редко используется для высокоэффективного синтеза продукта (Yanisch-Perron et al., 1985). Синтетические промоторы tac и trc, включающие (-35) район trp промотора и (-10) район lac промотора, являются значительно более сильными и обеспечивают уровни экспрессии до 15-30% общего клеточного белка (de Boer et al., 1983; Brosius et al., 1985). Такие промоторы контролируются репрессором лактозного оперона: синтез продукта достигается внесением в среду аналога лактозы IPTG. Сходную структуру и регуляцию имеет гибридный промотор Т5 в векторах серии pQE фирмы Qiagen.
Одной из альтернатив регуляции экспрессии является использование позднего промотора фага Т7 (Tabor and Richardson, 1985; векторы серии рЕТ фирмы Novagen), специфически транскрибируемого РНК полимеразой фага. При этом ген Т7 РНК-полимеразы клонируется in trans под контролем промотора lacUV5, индуцируемого IPTG. Хотя эта система обеспечивает уровни экспрессии до 30-50% общего белка (Baneyx, 1999), она не лишена недостатков. Например, высокие уровни мРНК могут вызывать деградацию рибосом, а базовый уровень экспрессии Т7 РНК полимеразы может приводить к нестабильности плазмиды (Miroux and Walker, 1996). Более того, даже «пустые» рЕТ векторы могут быть токсичны для клетки в присутствии IPTG (Miroux and Walker, 1996).
Общим же недостатком всех производных lac промотора следует считать достаточно высокий базовый уровень экспрессии, препятствующий высокоэффективной экспрессии белков, которые могут быть токсичны для клетки. Так, диапазон регуляции Plac промотора составляет всего 80-100 раз, что обуславливает достаточно высокий уровень его активности в отсутствие индуктора (Guzman et al., 1995, Yanisch-Perron et al., 1985). Эта проблема сохраняется и для векторов серии рЕТ, поскольку ген Т7 РНК полимеразы в этих системах клонируется под контролем имеющего достаточно высокий базовый уровень экспрессии промотора lacUV5, индуцируемого IPTG.
Другим широко используемым регулируемым промотором является araPBAD, промотор арабинозного оперона Е. coli, коммерциализованный фирмой Intirogen. Этот промотор обладает широким диапазоном регуляции, однако он является менее эффективным, чем, например, tac промотор (Guzman et al., 1995). Кроме того, недостатком этой системы является гетерогенность клеточной популяции в условиях неполной индукции промотора, когда в некоторых клетках наблюдается полная индукция, в то время как в других - ее отсутствие (Siegele and Hu, 1997).
Наряду с бактериальными промоторами для регулируемой экспрессии используются также узнаваемые РНК-полимеразой клетки-хозяина промоторы фагов, в частности PL промотор фага лямбда. Репрессия этого промотора достигается за счет экспрессии температурочувствительного мутанта лямбда-репрессора CI857, индукция происходит при повышении температуры с 30°С до 42°С (Elvin et al., 1990). Основным недостатком этой системы экспрессии также является высокий базовый уровень экспрессии, обусловленный как неполной репрессией мутантным CI белком, так и тем, что P L промотор является холодоиндуцибельным (Giladi et al., 1995).
16.Экспрессия белков с использованием с регулируемыми элементами фага лямбда.Регулируемые промоторы
В качестве примера рассмотрим две системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках E. coli. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют систему регуляторных элементов лактозного оперона, в другом - систему промотор-репрессор-оператор фага лямбда.Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в обоих случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуляторные последовательности фага лямбда или lac-оперона, за которыми следуют последовательности нуклеотидов полилинкера с несколькими уникальными сайтами рестрикции, по которым проводится клонирование исследуемого гена. Одновременно в тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия молекулы репрессора, ген которого экспрессируется конститутивно, связываются с оператором, препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, под контролем которого находится клонированный рекомбинантный ген. Это приводит к резкому снижению уровня транскрипции клонированного гена, низкому внутриклеточному содержанию соответствующей мРНК и белкового продукта ее трансляции. ДНК профага может экспрессироваться в тех случаях, когда наблюдаются признаки стресса в клетке-хозяине. Стресс может быть вызван голоданием, ядами (например антибиотиком), или другим факторами, которые могут повредить или уничтожить хозяина. В этом случае профаг активируется, выделяет себя из ДНК клетки-хозяина и вводит ее в литический цикл. Активированный фаг уничтожает ДНК хозяина и производит большое количество собственной мРНК, чтобы произвести множество единиц фага. Когда все ресурсы хозяина исчерпаны от построения новых фагов, клетка-хозяин разрушается, клеточная мембрана разрывается, и новые фаги выходят во внешнюю среду.
Некоторые λ-векторы содержат ген β-галактозидазы.
При создании рекомбинантного λ-вектора вместе с несу-
щественной областью удаляется и ген β-галактозидазы. При
инфицировании
бактериальных
клеток,
выращиваемых
на среде с X-gal, нерекомбинантным λ-вектором, на их
колониях будут формироваться голубые бляшки. При
инфицировании же бактериальных клеток рекомбинантным
λ-вектором – будут формироваться бесцветные бляшки. Так
можно различить рекомбинантный и нерекомбинантный
λ-векторы.
16.2 Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к PHК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке (и исследователю) осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученного lac (лактозного)-оперона E, coli. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезными для контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным промотора, встраивают случайные фрагменты ДНК (рис. 6.1), Если в результате такой вставки ген-репортер эффективно экспрессируется, то делают вывод, что клонированный фрагмент содержит функциональный промотор. Большинство генов-репортеров кодируют либо продукты, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, либо фермент, который идентифицируется с помощью достаточно простого колориметрического теста.
17.Системы экспрессии на основе бакуловирусов. Продукция больших количеств белков в клетках насекомых.
Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе многих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются две их формы. Одна представлена отдельными вирио-нами, которые высвобождаются из инфицированной клетки хозяина, как правило клетки средней кишки, и способны инфицировать другие клетки этого органа. Вторая состоит из множества вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса называется полиэдрином, а сама структура — полиэдроном. Синтез полиэдрина начинается через 36—48 ч после инфекции и продолжается 4—5 сут, пока зараженные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инактивации их защищает белковый матрикс. Если восприимчивый хозяйский организм проглатывает такую частицу, то полиэдрин солюбилизируется и высвобождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл.
Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего геном чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтезу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме того белка, который интересует исследователя. Исходя из этого на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных.
Наиболее широко используется вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Этот бакуловирус инфицирует более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих клеточных линий. Линии клеток, обычно использующиеся для работы с рекомбинантнымAcMNPV, получают из гусениц Spodoptera frugiperda. Промотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка.
Первый шаг в конструировании рекомбинантного бакуловируса AcMNPVсостоит в создании транспортного вектора. Транспортный вектор - это производная плазмиды E. coli, содержащая фрагмент ДНКAcMNPV(рис. 7.8), который включает: 1) промоторную область и расположенную перед ней последовательность ДНКAcMNPV, необходимую для гомологичной рекомбинации сAcMNPV; 2) сайт для клонирования; 3) сайт терминации-полиаденилирования гена полиэдрина и прилегающую к нему последовательность ДНКAcMNPV— вторую область, обеспечивающую гомологичную рекомбинацию сAcMNPV(рис. 7.8). Кодирующая последовательность гена полиэдрина из этого фрагмента удалена. Интересующий исследователя ген встраивают между промотором и сигналом терминации гена полиэдрина и вводят конструкцию в Е. соli.
Культуру клеток насекомого, трансфицированную ДНК AcMNPV, трансфицируют затем транспортным вектором, несущим клонированный ген. В некоторых дважды трансфицированных клетках происходит двойной кроссинговер, в результате которого клонированный ген вместе с промотором и сигналом терминации транскрипции гена полиэдрина встраивается в ДНКAcMNPV(рис. 7.9), замещая ген полиэдрина. Вирионы, не содержащие этого гена, образуют зоны клеточного лизиса, из которых можно выделить рекомбинантный бакуловирус.
Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадии литического цикла, поместить ген lacZ E. coli., кодирующийß-галактозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геномAcMNPV, то в присутствии хромогенного субстратаß-галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет.
18.Системы для экспрессии белков в клетках животных. Векторы экспрессии на основе вирусов животных.
вирус SV40, вирус папилломы, аденовирусы, вирус герпеса, ретровирусы
Дата добавления: 2016-01-04; просмотров: 52; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!