Векторы на основе вируса SV40

Особенности строения вируса SV40

-гены SV40 в значительной степени перекрываются

-представляют собой кольцевую ДНК длиной 5 243 пн

-область начала репликации (ori) перекрывается с промоторными последовательностями ранней и поздней транскрипции

-белок Т-антигена является единственно необходимым для эффективной репликации вируса в инфицированных клетках

-Внедрение вируса в хромосомную ДНК не является сайт-специфическим

-при получении рекДНК важно сохранить неповрежденным участок начала репликации

-вставки или делеции без потери жизнеспособности SV40 могут происходить ограниченно: большинство векторов на основеSV40 получено замещением участка ДНК области поздних генов вируса по сайтам Hpa II, Eco RI, Bam HI, Hae II, Acc I, Kpn I

-Впервые экспрессия эукариотического гена β-глобина кролика была достигнута в лаборатории П. Берга в 1979 г

19. Электрофоретический анализ белков. Иммуноблоттинг и иммунодетекция. Аффинная хроматография белков.

19.1 Электрофоре́з белко́в — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки, основанный на движении заряженных белковых макромолекул различного молекулярного веса в стационарном электрическом поле. Электрофорезбелков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.

Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии и молекулярной биологии) в различных областях^[3]:

· Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)

· Электрофорез с подвижной границей

· Зональный электрофорез без поддерживающей среды

· Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой

· Электрофроез белков в крахмальном геле^[4]

· Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)^[5]

· Электрофорез белков в агарозном геле

· Электрофорез на фильтровальной бумаге

· Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране

· Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды

· Капиллярный электрофорез

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D) электрофорез^[6], препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков^[en] и электрофорез в присутствии детергента (в денатурирующих условиях). Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусированиеи изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.

В зависимости от конструкции электрофоретического аппарата различают горизонтальный и вертикальный электрофорез белков.

19.2 В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с после­дующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесен­ную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предвари­тельного фракционирования методами электро­фокусирования, диск-электрофореза или дву­мерного электрофореза — Вестерн-блот ана­лиз (Western blotting). Такая методология при­меняется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продук­ты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пас­сивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факто­ров, таких как молекулярная масса белков, по­ристость геля, время переноса и состав исполь­зуемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты.

В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуорид- ные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны.

Нитроцеллюлоза может связывать до 80- 100 мкг белка на 1 см2. Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок

после электропереноса, что снижает чувстви­тельность, однако использование глутарового альдегида для фиксации белков или нитроцел­люлозы с мелкими порами (0,2 мкм) значитель­но снижает эти потери. Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе доде- цилсульфата натрия (SDS), могут слабо перено­ситься на мембрану, если в транс-буфере при­сутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задерж­ке крупных белков. Мембрана ПВДФ оптими­зирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшие­ся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания. Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее мно­гократного использования. Нейлоновые мембра­ны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-бел- ки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низко­молекулярные белки также удерживаются эф­фективно. Благодаря высокой связывающей ем­кости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембра­ны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следо­вые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммо­билизованным на мембране, оставшиеся цент­ры связывания блокируют растворами желати­на, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока. Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти­

гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phos­phatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Sta­phylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-об- ласти иммуноглобулинов. Детекцию образован­ных иммунных комплексов проводят химиче­ским или хемилюминесцентным способом.

Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфа­тазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при ис­

пользовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода. В резуль­тате ферментативных реакций на мембране об­разуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело. Чув­ствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP.

Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью во­дорода и циклическим диацилгидразинлюми- нолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.

19.3 Аффинная хроматография — разновидность лигандной хроматографии. В основе последней лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специфическое биохимическое взаимодействие. Например: антитело-антиген, гормон-рецептор и т. д. Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и её широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение.

20. Введение ДНК в клетки животных, растений, бактерий, дрожжей.

Необходимый этап генно-инженерного экс­перимента — введение полученных in vitro гиб­ридных молекул ДНК в пермиссивные клетки (обеспечивающие репликацию этих молекул) с целью размножения, селекции и выделения клонов гибридов.

Введение в клетку нуклеиновой кислоты ви­руса с последующим образованием вирусного потомства называется трансфекцией. Эффек­тивность трансфекции выражается обычно ко­личеством инфекционных центров (бляшек, не­гативных колоний), приходящихся на молекулу или на единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Вирусные клоны, полученные после трансфекции из отдельных бляшек, называют трансфектантами. Следует отметить, что нук­леиновые кислоты некоторых типов вирусов не- инфекционны, т. е. неактивны в тесте трансфек­ции. Это обусловлено тем, что для инициации экспрессии генома данных вирусов необходи­мы определенные вирусспецифические белки, содержащиеся в вирусных частицах, но отсут­ствующие в препарате очищенной нуклеиновой кислоты.

Процесс, в результате которого экзогенная ДНК проникает в реципиентную клетку и вы­зывает у нее наследуемые изменения, называют трансформацией. Трансформацию клеток мо­гут осуществлять как молекулы ДНК, реплици­рующиеся в клетках внехромосомно (плазми­

ды), так и молекулы ДНК, интегрирующиеся в геном клетки (линейные и кольцевые моле­кулы ДНК). Генетически трансформированные клетки принято называть трансформантами. Эффективность трансформации обычно выра­жают количеством клонов (колоний, образован­ных в результате делений исходно единичной клетки) трансформантов, приходящихся на мо­лекулу или единицу массы донорной ДНК. Дан­ную генетическую (биохимическую) трансфор­мацию необходимо отличать от онкогенной трансформации эукариотических клеток.

Физиологическое состояние клетки, в кото­ром она способна поглощать нуклеиновую кис­лоту из окружающей среды, называется компе­тентностью. Однако многие бактерии, а так­же дрожжи и культивируемые клетки животных и растений такой физиологической компетент­ностью не обладают. Поэтому восприимчивость к экзогенной ДНК у них индуцируют различны­ми способами. Такую компетентность принято называть индуцированной. Наиболее просто она достигается путем определенного химиче­ского или физического воздействия на клетки. Разные типы клеток имеют свои особенности строения клеточных стенок и плазматических мембран, поэтому они могут различаться по способам индукции у них компетентного со­стояния.

Исторически первым подходом к получению компетентных для трансфекции (трансформа­ции) клеток бактерий является ферментатив­ный гидролиз клеточных стенок, приводящий к удалению физического барьера на пути про­никновения молекул ДНК в клетку. Для этой цели можно использовать различные индиви­дуальные ферменты (например лизоцим) или смеси ферментов (например пищеварительный сок виноградной улитки). При ферментативной обработке клетки необходимо помещать в изо­тонический раствор (0,2 М сахароза; 1 М сор­бит; 0,6 М КС1 и др.), имеющий примерно такое же осмотическое давление, какое характерно для цитоплазмы клетки. В этих условиях клет­ки, лишенные своего жесткого «панциря» (кле­точной стенки), приобретают шарообразную форму и не лопаются от осмотического шока, наблюдаемого в гипотонической среде.

В 1982 г. Т. Вонг и Е. Нейман с сотрудника­ми для введения молекул ДНК в культивируе­мые клетки мыши применили метод, получив­ший название электропорация. В последую­щие годы метод был усовершенствован, что по­зволило использовать его эффективно как для

эукариотических, так и для прокариотических клеток. Суть данного подхода состоит в том, что кратковременное воздействие (обычно 5-20 мс) электрического поля высокой напря­женности (1-15 кВ/см) на клеточную мембрану приводит к образованию в ней пор (электропро­бой). Время существования и размер пор доста­точны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в ре­зультате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каждой систе­мы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы добиться высокой частоты поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оп­тимальных условиях электропорации количест­во трансформантов может достигать 80 % вы­живших клеток.

Электропорация — физический, а не хими­ческий метод, и это, по-видимому, обусловли­вает его широкое применение. Электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простей­шие, дрожжи, бактерии и протопласты расте­ний.

Электропорирующий эффект высоковольт­ного разряда на бислойную липидную мембра­ну, по-видимому, зависит от радиуса ее кривиз­ны. Поэтому для эффективного поглощения ДНК мелким бактериальным клеткам требуется значительно большая напряженность электри­ческого поля (10 кВ/см и более), чем крупным животным и растительным клеткам (1-2 кВ/см).

Электропорация — наиболее простой, эф­фективный и воспроизводимый метод введе­ния молекул ДНК в клетки. Однако до недавне­го времени он использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием се­рийных приборов — электропораторов. Появ­ление и совершенствование таких приборов привело к широкому применению данного ме­тода в генетической инженерии самых разных типов клеток.

Разработка простых, эффективных и воспро­изводимых методов введения экзогенных моле­кул ДНК в нативной форме в пермиссивные клетки является необходимым условием успеш­ного развития работ по клонированию чужерод­ной генетической информации в клетках любо­го типа. Поэтому данному направлению иссле­дований уделяется пристальное внимание и оно постоянно развивается.

 

 

21. Выделение и очистка плазмидной ДНК в миниколличествах.

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.

Амплификация в богатой среде

Амплификацию плазмид производят при выращивании бактерии-хозяина в богатой среде в присутствии хлорамфеникола. Ночную культуру (10 мл LB c добавлением антибиотика) пересевают в свежую среду LB (0.2 мл н.к. в 25 мл LB c антибиотиком) и инкубируют пока культура не достигнет поздней логарифмической фазы (D600=0,6). Переносят культуру в свежую среду LB с антибиотиком (500 мл), инкубируют 2,5 часа (при этом титр удваивается), добавляют антибиотик до концентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще 12-16 ч.

Лизис клеток

Разрушения бактерий для последующего выделения биологически активной ДНК можно добиться разными способами.

- Механические. При этом происходят многочисленные разрывы ДНК.

- У многих бактерий наступает лизис после добавления анионного детергента додецилсульфата (или лаурилсульфата). В частности, так можно разрушить бактерии кишечной группы, пневмококки и гемофильные бактерии. Додецилсульфат не только разрушает клетки, но и денатурирует некоторые белки. Однако затем он должен быть полностью удален из лизата (что и достигается при последующих обработках), так как его примесь в трансформирующей ДНК мешает самому процессу трансформации.

Некоторые грамположительные бактерии нельзя разрушить только додецилсульфатом или другими поверхностно-активными веществами. Вначале нужно удалить клеточную стенку и затем применить тот или иной детергент. Для разрушения клеточной стенки чаще всего применяют лизоцим. При концентрациях, которые чаще всего применяются для разрушения бактериальных клеток (50-500 мкг/мл), функции лизоцима сводятся к разрушению клеточной стенки, в результате чего образуются хрупкие протопласты, легко разрушаемые детергентами. При больших концентрациях лизоцим может, видимо, влиять на связь ДНК с цитоплазматической мембраной и даже связываться с ДНК, осаждая ее. Кроме лизоцима, для той же цели употребляют проназу. Проназа способствует более полному гидролизу белка и поэтому лучшей последующей депротеинизации ДНК.

При разрушении бактерий в лизате в числе прочих ферментов появляются дезоксирибонуклеазы. Они, если действие их чем-либо не блокировано, могут тут же разрушить ДНК. Обычно от них защищаются, добавляя вещества, которые связывают ионы магния, требующиеся для работы большинства ДНКаз. Вещества, связывающие ионы магния (ЭДТА, цитрат), которые добавляют при лизисе клеток для инактивации дезоксирибонуклеаз и предохранения выделяющейся ДНК, подавляют поглощение ДНК компетентными клетками. Додецилсульфат и дезоксихолат также подавляют трансформацию. Лизоцим и проназа, остающиеся в лизате, сами могут лизировать компетентные клетки. В ряде случаев от нежелательных примесей, мешающих трансформации, можно избавиться за счет его разведения.

Для депротеинизации лизата при выделении ДНК используют обработку фенолом, который осаждает додецилсульфат и инактивирует все белки, в том числе и дезоксирибонуклеазы.

Очистка ДНК

В этих методах очистки так или иначе используют два основных различия между хромосомальной ДНК бактерий и плазмидной ДНК:

1) хромосомы бактерий по размеру много больше ДНК плазмид, обычно используемых в качестве векторов;

2) основная масса ДНК бактерий выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большинство плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул.

Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК бактерий, случайно захваченные обломки лизированных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как ДНК бактерий остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК бактерий также и при равновесном центрифугировании в градиенте хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистыйэтидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и поэтому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью. Эту методику используют, если необходима высокая степень очистки плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работы с рекомбинантной ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку больших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы препарат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирующими эндонуклеазами, лигирование, трансформацию и даже секвенирование ДНК можно проводить теперь, используя относительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, полученные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее препараты (например, в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5`-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

22. Методика трансформации клеток E. coli плазмидной ДНК.
Трансформация E. coli посредством плазмидной и бактериальной ДНК отличается некоторыми особенностями адсорбции и поглощения ДНК по сравнению с трансформацией у других бактерий и осуществима только в лабораторных условиях. Видимо, трансформирующая ДНК при этом на начальных стадиях претерпевает гораздо меньшие изменения, чем у тех бактерий, для которых трансформация является естественным процессом; она почти не фрагментируется и не образует однонитевых молекул. Однако внутри клетки поступившая в нее линейная ДНК в значительной мере разрушается АТФ-зависимой ДНКазой. Этим, видимо, объясняется то обстоятельство, что трансформация посредством хромосомной ДНК успешно проходит лишь в клетках, лишенных этого фермента (recBC sbcB). Кроме того, в таких клетках отсутствует и активность экзонуклеазы I. Такое сочетание мутаций возвращает клетке способность к рекомбинации. Считается, что рекомбинация при этом идет за счет иных механизмов, чем в клетках исходного генотипа, - по так называемому пути recF. Используют также другой класс мутантов – recBC sbcA. У них также отсутствует активность АТФ- зависимой ДНКазы, но появляется активность другой экзонуклеазы – так называемой экзонуклеазы VIII. Конкретные молекулярные механизмы рекомбинации здесь опять- таки не выяснены; путь, по которому у мутанта recBC sbcA идет рекомбинация, называется путем recE. В качестве реципиентных клеток в большинстве случаев используют штаммы С600hsdR-hsdM- и HB101hsdR-endA-recA-. Мутация hsdR, блокируя клеточную систему рестрикции, предохраняет тем самым клонируемые фрагменты от действия рестриктазы EcoK. Мутации endA- и RecA- предотвращают расщепление трансформирующей ДНК клеточными нуклеазами. После проникновения ДНК (инфекционной фаговой или плазмидной) в клетку нет последующего включения этой ДНК в хромосому. Как суперскрученная, так и релаксированная плазмидная ДНК трансформировала клетки с примерно одинаковой эффективностью. ДНК более крупных плазмид обладала худшей способностью к трансформации, чем ДНК мелких плазмид. Одновременное добавление к клеткам любой другой ДНК снижало выход трансформантов независимо от происхождения конкурирующей ДНК и ее размеров. Если для трансформации брали мономерную линейную ДНК плазмиды рВR322, предварительно превращенную в линейную, то количество трансформантов по сравнению с суперскрученной формой в клетках штамма с ненарушенной способностью к рекомбинации падало в 100-1000 раз. Если в качестве реципиентов были взяты мутанты recA, recBC и recF, то количество трансформантов посредством суперскрученной ДНК оставалось без изменения, а эффективность трансформации посредством линейной ДНК уменьшалось еще больше, чем в клетках исходного генотипа (дополнительно в 10-40 раз). Вероятно, в клетки кишечной группы бактерий, ставшие компетентными после обработки хлористым кальцием, может проникать кольцевая плазмидная ДНК, не претерпевая разрывов (в отличие от грамположительных микроорганизмов). Если же ДНК искуственно превращали в линейную, то она с достаточной низкой частотой рециркуляризовалась в клетке (как у бацилл, пневмококков и стрептококков). При этом превращение линейной формы в кольцевую происходило за счет внутримолекулярной рекомбинации между прямыми повторами. Этот процесс нуждался в рекомбинационных системах клетки (в частности,
в наличии АТФ-зависимой ДНК-азы, образование которой у кишечной палочки
детерминируется генами recВС) и был облегчен у димерных форм плазмид.
Применение так называемых tonB-мутантов, у которых изменена структура
клеточной стенки, в дополнение к мутациям recBC sbcAB позволяет повысить частоту образования трансформантов. Культура кишечной палочки обладает различнойспособностью к трансформации после обработки хлористым кальцием в разные периоды роста. В самом начале и конце роста культуры трансформантов почти не возникает. Наибольшее их число образуется, если берут клетки в середине-начале логарифмической фазы роста. Интересно, что именно на этот период падает максимальное снижение числа жизнеспособных клеток после соответствующих обработок. Тогда же наблюдается наибольшее «истечение» ферментов, расположенных в периплазматическом пространстве из клеток во внешнюю среду. Таким образом, у E. coli имеется стадия роста, в которую может быть сообщена компетентность при трансформации, и в этот период клетки наиболее «хрупки». Оптимальное значение рН для трансформации при кальциевой методике равно 7-8. Насыщающие концентрации ДНК при трансформации кишечной палочки несколько выше, чем у большинства микроорганизмов – около 10 мкг/мл. Зависимость количества трансформантов от концентрации ДНК при ненасыщающих концентрациях
близка к линейной. Судя по частоте появления трансформантов, число компетентных клеток в культуре при кальциевой методике составляют лишь незначительную часть популяции. В отличие от других бактериальных видов у кишечной палочки оптимальная величина фрагментов трансформирующей ДНК ограничена не только нижними, но и верхними пределами. Больше всего трансформантов образуется, если использовать ДНК с молекулярным весом 10-30 мегадальтон. Имеются косвенные данные, свидетельствующие о том, что трансформирующая ДНК кишечной палочки проникает в клетку в двунитевом состоянии и в дальнейшем не образует однонитевых структур. Трансформация посредством плазмидной ДНК может осуществляться и с помощью метода замораживания-оттаивания клеток. Эффективность трансформации была не ниже, чем при употреблении кальциевого метода. Методика сводится к непродолжительному замораживанию бактериальных клеток совместно с ДНК при – 70оС и последующему оттаиванию при 37оС. Поглощение ДНК происходит очень
быстро. В момент оттаивания, менее, чем за минуту; обработка ДНКазой оттаявшей
суспензии уже не препятствует трансформации. Судя по быстроте поглощения ДНК
здесь происходит поглощение ДНК не протопластоподобными структурами, а
интактными клетками.
При кальциевой методике применяется комбинация таких воздействий как
выдерживание клеток на холоду и их обработка хлористым кальцием. Хлористый
кальций может быть заменен хлористым барием и хлористым рубидием. Инкубация
при 37оС обязательна для генетической трансформации. Ионы кальция действуют лишь
при 37оС, т.е. на заключительных этапах обработки клеток.
Механизмы проникновения ДНК сильно различаются в зависимости от
применения той или иной из методик и мало изучены.
В случае возникновения компетентности при замораживании-оттаивании клеток
E. coli ДНК поглощают не протопласты, а интактные клетки, у которых из-за
соответствующей обработки резко меняется проницаемсть для макромолекул. Сам
молекулярный механизм такого поглощения неизвестен.
Существуют различные гипотезы о роли хлористого кальция при применении
кальциевого способа получения компетентных клеток E. coli. Ионам кальция
приписывалась определенная роль в нейтрализации отрицательных зарядов клеточной
поверхности, что может способствовать адсорбции также отрицательно заряженных
макромолекул ДНК. Предполагали, что хлористый кальций может денатурировать
какие-то белки на поверхности клетки, что также способствует адсорбции и
проникновению ДНК в клетку, или действовать на липиды клеточной стенки. Имеются
предположения об активации им ферментов-фосфолипаз, влияющих на проницаемость,
или гипотетических у E. coli ферментов, участвующих в активном транспорте ДНК. Во
всяком случае, эта обработка сокращает число жизнеспособных клеток, возможно,
повреждая их клеточные стенки; имеется обратная зависимость между выживаемостью
клеток и частотой генетической трансформации после кальциевой обработки.
Главный этап в молекулярном клонировании - введение рекомбинантной ДНК в
бактериальные клетки. В основе большинства методов бактериальной трансформации
лежит наблюдение, согласно которому обработка бактерий хлористым кальцием
увеличивает эффективность поглощения ими молекул ДНК. Выход трансформантов в
большинстве случаев составляет 105-107 на 1 мкг интактной ДНК бактерии.
Модификациями основного метода пытались увеличить эффективность трансформации
у разных штаммов бактерий. Можно подобрать условия, в которых штаммы бактерий
воспроизводимо дают 107-108 трансформантов на 1 мкг интактной ДНК. Следует
учитывать, что компетентна, т.е. способна поглощать плазмидную ДНК, только
небольшая фракция клеток (в трансформации участвует лишь 1 из 10000 молекул
ДНК). После проникновения в бактерию происходит репликация плазмидной ДНК и
начинается экспрессия маркеров устойчивости к лекарственным препаратам, в
результате чего трансформанты приобретают устойчивость к антибиотику.
Бактерии способны поглощать ДНК в течение короткого периода времени, но в
результате выдерживания с агентами, повышающими эффективность трансформации,
большинство бактериальных штаммов приобретает способность сохранять состояние
компетентности на протяжении 1-2 дней. Компетентные клетки можно приготовить в
больших количествах, проверить и хранить замороженными.
Главный этап в молекулярном клонировании - введение рекомбинантной ДНК в
бактериальные клетки. В основе большинства методов бактериальной трансформации
лежит наблюдение, согласно которому обработка бактерий хлористым кальцием
увеличивает эффективность поглощения ими молекул ДНК. Выход трансформантов в большинстве случаев составляет 105-107 на 1 мкг интактной ДНК бактерии.
Модификациями основного метода пытались увеличить эффективность трансформации
у разных штаммов бактерий. Можно подобрать условия, в которых штаммы бактерий
воспроизводимо дают 107-108 трансформантов на 1 мкг интактной ДНК. Следует
учитывать, что компетентна, т.е. способна поглощать плазмидную ДНК, только
небольшая фракция клеток (в трансформации участвует лишь 1 из 10000 молекул
ДНК). После проникновения в бактерию происходит репликация плазмидной ДНК и
начинается экспрессия маркеров устойчивости к лекарственным препаратам, в
результате чего трансформанты приобретают устойчивость к антибиотику.
Бактерии способны поглощать ДНК в течение короткого периода времени, но в
результате выдерживания с агентами, повышающими эффективность трансформации,
большинство бактериальных штаммов приобретает способность сохранять состояние
компетентности на протяжении 1-2 дней. Компетентные клетки можно приготовить в
больших количествах, проверить и хранить замороженными.

23. Методика постановки ПЦР.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp^[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований^[9].

Компоненты реакции[править | править вики-текст]

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

· Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

· Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза),Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

· Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

· Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию^[10].

24. Биотехнология утилизации целлюлозы.

Волокнистый материал, применяющийся при производстве бумаги и других продуктов, получают как из древесных, так и из травянистых растений после химического расщепления лигнина. Однако этот процесс сопровождается потерей большого количества древесины и образованием огромного количества отходов. Все это должно стимулировать разработку альтернативной химической технологии.

В настоящее время применяют два процесса получения древесной пульпы. Основной из них - это щелочная варка (сульфатный процесс), в результате которой образуется темная сульфатная варочная жидкость. Эти отходы содержат трудно перерабатываемые ароматические продукты расщепления лигнина и низкомолекулярные органические кислоты (глюкоизосахариновую, молочную, уксусную и муравьиную). При получении пульпы из смолистой древесины сосны образуются талловое масло и терпены, широко использующиеся в промышленности. Сульфатную варочную жидкость не удается перерабатывать биологическими способами, которые могли бы применяться в промышленном масштабе; гораздо экономичнее упаривать эту жидкость и сжигать ее, получая таким образом энергию из отходов.

Сульфатная варка целлюлозы применяется реже; она дает отходы следующего состава: лигносульфонаты с ароматическими элементами (60%), сахара (манноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, арабиноза (36%), уксусная кислота, метанол и фур-фураль). Эти жидкие отходы - хорошее сырье для ферментации благодаря высокому содержанию в них углеводов. Их ферментация в широких масштабах начата в 1909 г. В настоящее время традиционным методом удаления пентоз, гексоз и уксусной кислоты из таких отходов служит их ферментация при участии дрожжей. Помимо этих традиционных методов, вскоре будут использоваться и новые процессы превращения отходов в грибной белок с помощью Paecilomyces variotii, Sporotrichum pulveralentum и Chaetomicum cellulolyticum.Неподдающиеся переработке соединения можно концентрировать и сжигать. Лигносульфонаты применяют в качестве связывающих веществ и вспомогательных средств при бурении; щелочным окислением при повышенном давлении их можно превращать в ванилин. Вообще говоря, главное в переработке отходов целлюлозно-бумажной промышленности - это понижение энергозатрат, а какой химический принцип при этом используется, менее существенна.

Основная экологическая проблема, порождаемая целлюлозно-бумажной промышленностью, это очистка сточных вод, а также обработка конденсатов, образующихся в испарителях и реакторах. Сточные воды осветляют путем нейтрализации и отстаивания, окисления в одно- и двухстадийных установках с активным илом, в аэрируемых отстойниках или путем сочетания биологических и химических способов окисления. Эти методы пригодны для эффективного удаления соединений, подверженных биодеградации, а также токсичных производных фенола, однако они оказываются дорогими и неэффективными в случае производных лигнина, с трудом поддающихся переработке. Отбеливатели, содержащие хлорпроизводные бифенилов, можно обесцвечивать с помощью грибов - возбудителей белой гнили.

Среди побочных продуктов сульфитного процесса получения целлюлозы преобладают химически модифицированные лигнины, образующиеся во многих реакциях между активным сульфитом и каким-либо сложным природным полимером. Структура лигносульфонатов в деталях неизвестна. Они представляют собой гетерогенную смесь соединений с широким спектром молекулярных масс (300-100000); состав смесей определяется природой перерабатываемой древесины. Образование сульфонатов приводит к частичной солюбилизации лигниновых фрагментов. Сложность структуры лигносульфонатов затрудняет изучение их биодеградации. Для упрощения задачи обычно используют модельные соединения, например дегидрополимеры кониферилового спирта или другие низкомолекулярные продукты. Низкомолекулярные лигносульфонаты чувствительнее к биодеградации, чем высокомолекулярные; с другой стороны, производные лигнина, видимо, устойчивее к разрушению, чем сам лигнин. Следовательно, образование сульфопроизводных затрудняет переработку.

В таких сопряженных окислительно-деградативных процессах почвенные грибы и бактерии более эффективны, чем гнилостные грибы; для осуществления этих процессов требуется также дополнительный источник углерода. Распад лигносульфонатов нередко сопровождается полимеризацией, в результате чего наблюдается сдвиг в распределении полимеров по молекулярным массам. Эти изменения могут коррелировать с присутствием внеклеточных фенолоксидаз (например, лакказы), физиологическая роль которых остается неизвестной. Фенолы превращаются в соответствующие хиноны и фенокси-радикалы, которые спон-; танно полимеризуются. Таким образом, полимеризация и деградация происходят одновременно. Однако в случае некоторых грибов реакции полимеризации не протекают в присутствии целлюлозы. Целлюлоза распадается до целлобиозы, являющейся субстратом для целлобиоза: хинон оксидоредуктазы, которая одновременно окисляет целлобиозу и восстанавливает хиноны и фенокси-радикалы. Может существовать и другая оксидоредуктазная система, в которой легкодоступные источники углерода используются для восстановления хинонов. Возможная роль подобной биологической полимеризации состоит в облегчении осаждения лигно-сульфонатов. Лигносульфонаты применяются как связывающие вещества при производстве отдельных видов картона, где в качестве катализатора полимеризации используют содержащие лакказу культуральные фильтраты. Фенолоксидазы могут играть важную роль в определении судьбы многих ксенобиотиков в окружающей среде, участвуя в полимеризации фенолов и в образовании органических полимеров почвы.

Чувствительность лигносульфонатов к биодеградации увеличивается после их химической или физической модификации. Под действием УФ-облучения и озонирования происходит фрагментация этих молекул, а удаление остатков сульфоновой кислоты хотя и снижает растворимость лигносульфонатов, одновременно уменьшает их устойчивость к биодеградации. Предпринимались попытки использовать для микробного десульфирования анаэробные сульфатредуцирующие бактерии и некоторые виды Pseudomonas. Большими потенциальными возможностями в этом смысле обладают смешанные культуры. Использование таких культур для разрушения лигносульфонатов может оказаться более эффективным, чем применение отдельных штаммов, поскольку при этом могут быть созданы сообщества с широким спектром активностей, например, способные к десульфированию, расщеплению прочных связей, метилированию и деполимеризации. В результате может быть получена высокоэффективная биоокислительная система. В одной из опытных установок для получения БОО из углеводов, содержащихся в отходах целлюлозно-бумажной промышленности, используют Candida utilis, a для разрушения остаточных лигносульфонатов - смешанную культуру. Биомасса, образующаяся на второй стадии этого процесса, не находит сбыта, поэтому ее повторно используют после термообработки для ускорения роста Candida.

 

---

Дата добавления: 2016-01-04; просмотров: 85; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!