Технология секвенирования на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченых нуклеотидов
Технология секвенирования на молекулярных кластерах, так же как и пиросеквенирование, подразумевает синтез новой молекулы ДНК по матрице. Принцип секвенирования на молекулярных кластерах: полимеризация (синтез «дочерней» цепочки) ДНК с использованием флуоресцентно меченых нуклеотидов внутри специальной камеры, регистрирующей флуоресценцию.
Технология циклического лигазного секвенирования
Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК размером 25–75 п.о. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК лигируют адаптеры, необходимые для эПЦР на магнитных сферах и последующего секвенирования на проточной ячейке. Магнитные сферы с нанесенной на них клональной библиотекой помещают на проточную ячейку, где и происходит секвенирование с помощью лигирования восьминуклеотидных зондов, несущих четыре различных флуорофора на 5’-конце. Флуоресценция считывается с помощью специальной камеры после каждого цикла секвенирования и, затем переводится в последовательность нуклеотидов.
Ионное полупроводниковое секвенирование
Технология, предлагаемая в этой приборной линейке, основана на использовании полупроводниковых микрочипов для секвенирования. Суть этого подхода весьма проста и заключается в регистрации локального изменения рН на микрочипе в момент удлинения синтезируемой цепи ДНК-полимеразой на ДНК-матрице
|
|
|
Одномолекулярное секвенирование - SMRT-секвенирование (single molecule real time sequencing)
Смысл SMRT-секвенирования схож с описанными ранее методами NGS — ДНК-полимераза достраивает вторую цепь исследуемой молекулы ДНК, используя нуклеотиды, меченные различными флуоресцентными метками, которые регистрируют при помощи конфокальной микроскопии.
Использование секвенирования нового поколения позволяет проводить такие проекты как:
1. Полногеномный анализ
2. Секвенирование РНК (RNA-Seq)
3. Метагеномное секвенирование
4. Анализ ДНК-белковых взаимодействий (ChIP-Seq)
Использование секвенирования в научных и практических целях
· Геномный анализ - Стали доступны геномы разных по сложности живых систем от микроорганизмов до человека, включая геном цитогенетически находящихся в норме клеток миелоидной лейкемии. Увеличение длины чтений ускорило сборку целых геномов.
· Секвенирование отдельных участков генома
· Выявление делеций (выпадения участков НК) и инсерций (вставок)
· Идентификация вирусов и других организмов
· Применение в сочетании с другими методами - Использование СНП позволило определять места связывания белков с ДНК (ChIP-seq), взаимодействующие участки ДНК (Определение конформации хромосом) и участки открытого хроматина на протяжении всего генома.
|
|
|
· Метагеномика - широко используется в исследованиях разнообразия микроорганизмов в различных образцах (например, микробные популяции в океане и почве, идентификация новых вирусов в органах, подлежащих трансплантации, описание характерной для ЖКТ микрофлоры и т. д.)
· Секвенирование РНК
· Картирование ДНК-связывающих белков – идентификация регуляторных белков, ассоциированных с генами
· Перспективы применения секвенирования в медицине - В недалеком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификации мишеней для лекарственной терапии онкологических больных.
Молекулярная эволюция – процессы, на которых она основана.
Молекулярная эволюция - эволюционные преобразования макромолекулярных структур клеток и организмов (белков, нуклеиновых кислот).
Основные задачи
1. Выявление закономерностей эволюции генетических макромолекул
2. Реконструкция эволюционной истории генов и организмов
Изучение молекулярной эволюции основывается на двух совершенно разных дисциплинах: популяционной генетике и молекулярной биологии. Популяционная генетика дает теоретическую базу для изучения эволюционных процессов, тогда как молекулярная биология предоставляет опытные данные. Поэтому для понимания молекулярной эволюции необходимо знать основы как теории популяционной генетики, так и молекулярной биологии.
|
|
|
Главными методами изучения молекулярной эволюции служат: гибридизация ДНК, иммунологические тесты (используемые для определения групп крови), определение последовательности аминокислот (для гемоглобина, миоглобина, цитохрома с и т. п.), секвенирование ДНК, электрофорез (для различных ферментов) и биохимическая систематика (использующая разного рода вторичные метаболиты растений).
| В историческом плане вопрос об эволюции генов является важнейшим, поскольку эволюция генов связана с истоками жизни вообще и ее совершенствованием в частности. Поскольку выявлена изначальная роль в происхождении жизни РНК, то предполагают, что начало эволюции генов датируется 3,5-4 млрд лет назад, когда сформировались первые молекулы РНК, которые каким-то образом детерминировали синтез белков, т. е. были первыми хранителями генетической информации. Однако когда выявилась необходимость в повышении эффективности синтеза белков, способность кодирования генетической информации перешла к ДНК, которая стала главным хранителем генетической информации. Что касается РНК, то она оказалась между ДНК и белком, став «переносчиком» информации. Конечно, эта гипотеза не имеет доказательств. Тем не менее многие далее считают, что появление ДНК связано с усложнением структуры клеток и, следовательно, необходимостью кодирования большого количества информации по сравнению с РНК. Другими словами, с началом участия ДНК в хранении генетической информации стал развиваться генетический код.В последнее время большое внимание приобрела гипотеза, в соответствии с которой источником новых генов является рекомбинация эксонов, а также транспозоны, поступающие в геномы организмов.
|
16. Филогенетический анализ – принципы и возможности использования.
17. ДНК-чипы. Принцип использования и области применения
18. Механизмы переноса чужеродной ДНК в клетки-реципиенты.
19. Векторные системы переноса генетической информации.
20. Стволовые клетки – классификация и методы получения.
21. Прионы
22. Генетические болезни – общая классификация.
23. Синдром Дауна и семейная гиперхолестеринемия – генетические механизмы и клинические проявления.
24. Гемофилия и дальтонизм - генетические механизмы и клинические проявления.
Дата добавления: 2018-09-20; просмотров: 515; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!