Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)- зеленая и розовая коробки- для выделения ДНК возбудителя
Этапы:
1).Выделение ДНК (РНК) из исследуемого материала – проба-подготовка.Исследуемый материал разрушают детергентами или высокой t. Затем отделяют ДНК от клеточных обломков и разрушают клеточные нуклеазы
2).Амплификация- увеличение выделенных участков (копий) нуклеиновых кислот. Для этого в пробирку с выделенной ДНК добавляют необходимые реактивы и помещают в амплификатор. Если в пробирке есть искомая ДНК, то в ней происходит ряд процессов:
-в результате нагревания до 94-95 С двойная цепь ДНК делится на 2 отдельные цепи
-к одноцепочечной молекуле ДНК присоединяется праймер; при создании оптимальной t происходит связывание праймера с соответствующим участком ДНК; связывание проходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа
-синтез (элонгация)- достраивание второй цепи ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых цепей в следующем цикле амплификации- ПЦР
3).Определение (детекция) полученных продуктов ПЦР с помощью электрофореза в 2-3% агарозном геле, содержащем бромид этидия (краситель ДНК). Поглощая УФ свет, краситель, связанный с ДНК, светится -> видна оранжевая полоска на уровне ДНК- положительная реакция.
Двухфазная среда «НАКОПЛЕНИЯ» для гемокультур, которые растут на кровяных средах
Одна фаза- агаровая
Другая фаза- бульонная
Как правило у постели больного открывается флакон, берется кровь для исследования, засеивается путем прокола крышки в эту среду. Флакон ставится наклонно, чтобы бульон покрывал стенки и ставится в термостат, культивируется и можем определить колонии, выделить культуру. Дальше идентификация бак.методом.
|
|
|
Определение лецитиназной активности, дифференциальная диагностика между возбудителем Сибирской язвы (Bacillus anthracis) и другими бациллами.
Лецитиназной активностью обладает сибирская язва.
Среда Левенштейна-Йенсена для культивирования микобактерий
Это картофельно-глицериново-яичная среда с добавлением аспарагина и малохитовой (бриллиантовой) зелени. В эту среду добавляют микобактерии-> колонии имеют вид светло-кремового морщинистого сухого налета с неровными краями
Проба Пизу и Закса на дифференцировку дифтерийной палочки от дифтероида
| Дифтерийная палочка | Дифтероид |
| Посев культуры в среду с цистином-> выявление цистиназы (наблюдается образование черного облачка) -> ПРОБА ПИЗУ + Посев культуры в среду с мочевиной -> выявление уреазы (цвет среды не изменился) -> ПРОБА ЗАКСА - | ПРОБА ПИЗУ – (нет почернения) ПРОБА ЗАКСА + (с желтого на красный) |
|
|
|
Реакция иммунофлюорисценции (ИФА) для диагностики ВИЧ, Сифилиса (планшет по вертикали английский алфавит)
АГ на дне лунки + сыворотка пациента, промываем лунку + антиглобулиновый конъюгат с пероксидазой, промываем + добавляем H2O2 и индикатор. Если в сыворотке есть АТ, образуется иммунный комплекс АГ+АТ+конъюгат (антитета к антителам человека). К этому комплексу добавляется H2O2 и индикатор. Пероксидаза начинает разрушать H2O2. По изменению цвета индикатора в лунке, судим о наличии или отсутствии антител. Каждая лунка- один пациент.
Среда Игла и среда 199- это синтетические среды для роста культуры клеток
Синтетическая среда содержит витамины, соли, углеводы, факторы роста. Эта среда добавляется во флакон, куда потом добавляют культуры клеток для их роста.
31.Окраска по Граму для отличия грам+ и грам-
Грам+ окрашиваются в сине-фиолетовый
Грам- окрашиваются в красный
Техника окраски:
§ Фиксированный мазок кладут на бактериологический мостик, покрывают полоской фильтровальной бумаги, пропитанной раствором генциан-виолета, на эту полоску наносят воду, через 2 минуты полоску удаляют
§ Не промывая препарат водой, р-р Люголя наносят на 1 минуту, затем сливают
|
|
|
§ Препарат обесцвечивают спиртом 20-30 сек до отхождения фиолетовых струек краски (грам+ отсаются фиолетовыми, а грам- обесцвечиваются)
§ Препарат промывают водой
§ Окрашивают водным фуксином 2 минуты (грам- приобретают красный цвет)
§ Промывают водой
§ Высушивают на воздухе или фильтровальной бумагой
Техника приготовления мазка
1.Мазки готовят на обезжиренных предметных стеклах, предварительно обрисовав карандашом по стеклу место будущего мазка с противоположной стороны стекла.
2.При росте бактерий на жидкой питательной среде, материал берут стерильной бактериальной петлей, наносят на стекло и растирают над очерченной площадкой. При росте бактерий на плотной среде, материал наносят на стекло петлей каплю воды и материал растирают рядом с каплей посуху, затем вносят петлей воду, готовя однородную взвесь.
3.Бактериальную петлю перед использованием и с оставшейся культурой стерилизуют в пламени горелки.
4.Приготовленный мазок высушивают на воздухе или держа высоко над пламенем горелки.
5.Фиксация препарата: стекло, где нет материала, троекратно проводят через середину пламени горелки для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, и для лучшего их окрашивания.
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 248; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!