Разрушение клеточной массы (дезинтеграция)
Для извлечения целевых продуктов, находящихся внутри клеткимикроорганизма или при получении продуктов из тканей животных илирастений, необходимо прежде всего разрушить их или осуществитьпроцедуру дезинтеграции.
Дезинтеграция клеточной массы представляет собой один из важнейших элементов биотехнологического процесса. Эту процедуру осуществляют физическими, химическими или ферментативными методами.
Наиболее распространенными в промышленности являются физические методы, среди которых чаще всего применяют баллистическиеметоды дезинтеграции. Сущность этой группы методов состоит в том,что биомассу подвергают воздействию удара или истирания.
В первомслучае биомассу помещают в цилиндрический барабан, вращающийсявокруг оси и наполненный шариками из тяжелого твердого материала(металл или фарфор). При вращении барабана шарики перекатываютсяи ударяют по агломератам биомассы, причем удары происходят достаточно часто и в разных направлениях. Это приводит к разрушению клеточных стенок и получению однородного вязкого раствора, в которомнаходится содержимое клеток. Однако следует учитывать, что в ходетакой обработки содержимое барабана существенно нагревается от соударений. Учитывая термолабильность компонентов клетки, это тепло необходимо удалять, что достигается введением в конструкцию дезинтегратора теплоотводящих элементов. Обычно это рубашка (кожух, вкоторый помещают барабан), через которую пропускают холодную воду или другой хладоагент. Степень дезинтеграции (доля разрушенныхклеток) за один цикл составляет 52–85 %, в зависимости от вида подвергаемой обработке биомассы.
|
|
|
Другим способом механической дезинтеграции клеток являетсяэкструзия. Сущность этого метода заключается в том, что суспензиюклеточной массы под высоким давлением продавливают через узкое отверстие в камеру с нормальным давлением. При этом из-за большогоперепада давления вода, которая попала в клетки, быстро выходит изних и при этом разрушает клеточную стенку. Кроме этого происходитразогрев и также необходимо охлаждение во избежание потерь продукта из-за термоинактивации. Степень разрушения клеток при таком способе составляет до 90 %.
Ультразвуковая дезинтеграция. Помимо механических способовиспользуются приемы, основанные на воздействии на клетки ультразвука. Под действием ультразвукового поля клетки испытывают попеременные сжатия и растяжения, скручивание в различных направлениях,что, в конце концов, приводит к разрыву клеточной стенки и ее разрушение.
Как и в случае баллистических методов, операция дезинтеграции спомощью ультразвука может осуществляться как в периодическом, таки в непрерывном режимах. Для этой цели сконструированы специальные ячейки, позволяющие прокачивать суспензию разрушаемой биомассы со скоростью нескольких литров в минуту при концентрацииклеток в суспензии до 20 % и поддерживать при этом температуру 2–4оС. Для более полного разрушения биомассу можно возвращать в цикл.
|
|
|
Химические методы разрушения клеток.
Как различные методымеханической дезинтеграции, так и ультразвуковая дезинтеграция биомассы основаны на использовании механического разрыва клеточной
оболочки – либо ее абразивное разрушение, либо разрыв ее за счет осмотических сил.
В ряде случаев более удобным оказывается разрушение клеточнойоболочки за счет перевода в раствор отдельных ее компонентов, т. е.изменения ее состава и структуры, что делает ее более проницательнойдля клеточного содержимого.
Одним из таких методов является детергентный лизис клеток.Биомасса продуцента в этом случае обрабатывается каким-либо из детергентов, который растворяет липидные компоненты клеточной стенки, после чего внутриклеточные компоненты через образовавшиеся поры вытекают в окружающую среду.
|
|
|
Фракционирование экстрактов биоматериалов
Существует несколько подходов к фракционированию смесей.Один из низ – неспецифический, когда, располагая ограниченной информацией о свойствах продукта, мы проводим его через ряд последовательных стадий технологического процесса в надежде, что на каждойиз этих стадий удастся реализовать какие-либо различия в свойствахцелевого продукта и сопутствующих ему веществ. В принципе, можноутверждать, что всегда найдется такая комбинация приемов фракционирования, которая позволит получить целевой продукт в достаточноочищенном состоянии, однако, следует иметь в виду, что каждая технологическая стадия сопровождается неизбежными потерями продукта, иесли число таких стадий будет велико, то выход конечного продуктаокажется низким, что приведет к его удорожанию и снижению экономических показателей процесса.
Второй подход основан на большем объеме информации о продукте и, следовательно, на подборе специфических для него приемов фракционирования. Таким путем можно сократить затраты на процесс производства, повысить выход продукта и экономичность технологии, ноэто потребует больших затрат на разработку процесса.
|
|
|
Основные принципы фракционирования сложных смесей удобнорассмотреть на неспецифических процедурах.
Солевое фракционирование. Этот тип фракционирования основан на различии растворимостипродукта в солевых растворах различной концентрации. Обычно дляэтих целей применяют сульфаты, фосфаты натрия, калия и аммония. Ксуспензии биомассы добавляют 10 %-й раствор сульфата аммония, приэтом наименее растворимые побочные продукты (обычно белки) выпадают в осадок, их отделяют центрифугированием и добавляют следующую порцию сульфата аммония 20 %-й концентрации, после чего получают второй осадок, т. е. продолжая эту процедуру получают ряд фракций, в которых содержание целевого продукта значительно выше, чем вдругих фракциях.
Точно таким же образом можно фракционировать суспензии добавлением органических растворителей, постепенно увеличивая ихконцентрацию. Чаще всего в качестве осадителей используют этанол иацетон. Можно также применять метанол, изопропанол, диоксан, этилацетат и др., однако при использовании органических растворителейстановится крайне важным соблюдение норм техники безопасности ипожарной безопасности, так как органические растворители токсичны игорючи. Это требует использования оборудования во взрывозащищенном исполнении, эффективной вентиляции и применения средств индивидуальной защиты.
Осаждение продуктов органическими полимерами. Помимо солей и органических растворителей агрегацию белков врастворах вызывают и ряд нейтральных высокомолекулярных соединений. Однако растворы полимеров обычно имеют повышенную вязкость,поэтому для целей фракционирования используют полимеры, образующие растворы с минимальной вязкостью. Среди таковых наиболееудобными оказались полиэтиленгликоли (М.м. 4000–6000). Растворыполиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 имеют небольшуювязкость, вплоть до концентрации 20 вес %.
Полиэтиленгликоль, в частности, используется для фракционирования плазмы крови. Первым из плазмы крови при добавлении полиэтиленгликоля выпадает фибриноген – крупный белок с ассиметрическими молекулами; далее осаждаются гамма-глобулины и другие компоненты.
В случае полимеров определенные проблемы возникают при их отделении от целевых белков. Обычно это осуществляется с помощьюгель-фильтрации на молекулярных ситах типа Сефадекс и т. п. либо путем осаждения белка из раствора солью так, чтобы полимер при этом остался в растворе. Полиэтиленгликоль солевому осаждению практически не препятствует.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1062; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!