Приготовление посевного материала
Рис.2. Выращивание посевного материала1.пробирка с продуцентом на скошенном агаре
2. большое количество колб для выращивания молодой культуры (проверяют чистоту культуры под микроскопом. 3. инокулятор, мешалка4. посевной аппарат (с контролем)
Культуру продуцента хранят
v в запаянных ампулах
v в жидком азоте
v на твердых носителях – пшено, ячмень, рис.
v в лиофилизированном состоянии – лучше хранятся споры, чем живые клетки
v в ампулах в лиофилизированном состоянии на носителе (пшено, желатин - альгинат натрия)
v в пробирке на скошенном агаре – срок хранения до нескольких месяцев.
Такое количество стадий нужно для получения чистой культуры.
Многоэтапное выращивание посевного материала – обязательный принцип биотехнологического производства.
Среда для выращивания посевного материала обычно не совпадает по составу с ферментационной средой, т.е. при выращивании посевного материала среда может быть обогащена для быстрого роста биомассы.
Культивирование
Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной.
Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов:
|
|
|
1. культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды (поверхностный способ выра-щивания продуцента),
2. культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента).
Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И.Такамине еще в 1894 г., состоит в культивировании микроорганизмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроорганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постепенном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.
В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов; чаще используют более экономный — глубинный метод культивирования (рис. 3). В промышленных условиях для этих целей применяют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные приспособлениями для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой культурой, подаваемой из специального генератора. Для предотвращения инфекции в ферментере поддерживают повышенное давления
|
|
|
| Воздух
Рис. 3. Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (по А.А.Свитцову и др., 1986): |
1 – смеситель питательной среды; 2 — стерилизатор в непрерывном режиме потока питательной среды; 3, 4 — теплообменники; 5 — посевные аппараты; б, 10, 12 — фильтры для очистки воздуха; 7 — ферментер; 8, 9 — насосы; 11 — компрессор
Промышленное культивирование и очистка целевого продукта – процессы много ступенчатые. Общая схема ферментации представлена на рисунке 4.
Микроорганизмы можно выращивать
Ø в ферментере периодического действия
Ø в ферментере периодического действия с добавлением субстрата
Ø в непрерывной культуре
Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов. Эта стадияосуществляется в биохимическом реакторе (ферментаторе) и можетбыть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта. Ферментация может происходить в строго асептическихусловиях или без соблюдения правил стерильности (так называемая«незащищенная» ферментация); на жидких и твердых средах, анаэробнои аэробно. Аэробная ферментация может протекать, в свою очередь, поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды). Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом.
|
|
|
В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания (рис. 5). При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются вэкспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты,витамины, т. е. вещества, которые требуются для роста культуры клеток) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики, алкалоиды,гормоны, токсины – низкомолекулярные вещества, не требующиеся дляроста культуры, но необходимые для функционирования зрелой популяции, часто выполняющие защитную функцию) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия длямаксимального производства того или иного целевого продукта.
|
|
|
Непрерывная ферментация биообъектов осуществляется в условияхустановившегося режима, когда микробная популяция и ее продуктынаиболее однородны, т. е. в стационарной фазе. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывнойферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения.
Рис. 5. Кривая роста микроорганизмов в ходе периодической ферментации:1 – лаг-фаза; 2 – фаза экспоненциального роста; 3- фаза линейного роста;4- фаза замедления роста; 5- стационарная фаза; 6- фаза отмирания
Первый пример – так называемая тубулярная культура: процессферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательная среда и инокулят, а с другой – стой же скоростью вытекает культуральная жидкость и целевые продукты. Данная система проточной ферментации является гетерогенной иреализуется, как правило, без перемешивания. При непрерывной ферментации в ферментаторах полного смешения (гомогенно-проточныйспособ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любомтребуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии.
Обеспечение процесса ферментации с точки зрения инженернойреализации сводится к дозированному поступлению в ферментатор потоков (инокулята, воздуха или газовых смесей, питательных биогенныхэлементов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также к измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимальногоразвития продуцента и образования целевого продукта. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этомцелевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольшихконцентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов.
Получение готовой продукции
Постферментационная стадия обеспечивает получение готовойтоварной продукции и также обезвреживание отходов и побочных продуктов. Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазесодержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотребленные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира и пузырьки воздуха. В свою очередь, водная фаза культуральнойжидкости (нативный раствор) включает большое количество органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости – до 17 % и более, содержание биомассыв культуральной жидкости достигает 8–10 %. Концентрация целевогопродукта чаще всего не превышает 1,5 %, что составляет менее 10 % сухого остатка.
В зависимости от целевого назначения конечного продукта (дляздравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.), локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру, методы выделения и очистки. Наиболее трудоемковыделение продукта, накапливающегося в клетках.
Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы – биомассы. Наиболее распространенный метод для этих целей – сепарация,осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые работают по различным схемам, в зависимости от свойств обрабатываемойкультуральной жидкости. Основные проблемы возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц размером 0,5–1,0 мкм именее (бактериальные клетки) и переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка). Для повышения эффективностипроцесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры – изменение pH, нагревание, добавление химическихагентов.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1284; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!