Мутагенез и методы выделения мутантов
Повышение продуктивности микроорганизма как продуцента сводится кселекции и мутагенезу. Селекционная работа с микроорганизмом состоитв поиске природных форм, которые обладают какими-либо полезными длячеловека свойствами (например, синтез БАВ, высокая скорость роста,способность усваивать дешевые среды и так далее,в дальнейшем совершенствовании его,в создании на его основе промышленных штаммов.
Методы современной селекции – это генетическое конструирование, когдаможно изменить генетическую программу микроорганизма.
Генетическое конструирование в живой клетке in vivo включаетполучение и выделение мутантов с использованием различных способовобмена наследственной информацией живых микробных клеток.
Генетическое конструирование in vitro основано на применениигенетической инженерии, которая манипулирует выделенной из организмаДНК.Каждый организм имеет свой генотип и фенотип
Биотехнолог для совершенствования биообъекта использует:
• наследственные изменения фенотипа, которое передается понаследству;
• наследственное изменение генотипа.
Мутации различают цитоплазматические (внехромосомные) и ядерные(хромосомные).
Наследственные изменения называются мутациями в геноме, но есть ивнехромосомные изменения. Таким образом, мутации проявляются насубклеточном и молекулярном уровне. Хромосомные мутации включают триосновных типа:
|
|
|
1. изменение числа хромосом
2. изменение числа и порядка расположения генов (перестройка хромосомведет к структурным изменениям)
3. изменения индивидуальных генов (внутригенные изменения)
В селекции микроорганизмов основное значение имеют два последнихтипа мутаций.
Важной характеристикой мутантов является их способность к реверсии, тоесть возвращения к исходному фенотипу (обратное мутирование).Мутанты, которые появляются в результате реверсии называютсяревертантами
Современная селекция основана на выделении клоновых культур.Клон – это генетически однородное потомство однойклетки (это колония, выросшая из одной клетки). Клоновая культура,имеющая наследственную однородность, называется штаммом.
Типы мутаций:
1. Делеция (стирание) – выпадение участков хромосомы или несколькихгенов.
2. Дупликация – удвоение генов.
3. Амплификация – умножение отдельных генов или группы генов.
4. Транспозиция - вставка участка хромосомы в новые места на хромосоме.
5. Инверсия – изменение порядка расположения генов на хромосоме, приэтом может быть утрата одних функций и приобретение новых.
6. Летальные мутации – это мутации, захватывающие слишком большиеучастки генома, в результате чего организм погибает.
|
|
|
7. Внутригенные мутации:
• точечные – изменение последовательности нуклеотидов в пределах
одного гена.
• транзиция или трансверсия – выпадение или вставка одного илинескольких оснований, например, транзиция – пурин замещается напурин или пиримидин на пиримидин, трансверсия – пуринзамещается на пиримидин.
Точечные мутации приводят к замене одной аминокислоты в белке надругую или к изменению конформации белковой молекулы, что можетпривести к потере активности фермента. Если белок регулятор илирепрессор, то это может привести к повышению выработки целевогопродукта продуцентом.
Вывод: совершенствование биообъекта – это получение биообъектов –продуцентов с мутациями в геноме, которые отличаются от исходногобиообъекта в сторону улучшения биотехнологических свойств, вчастности, в сторону увеличения образования целевого продукта.
Существуют традиционные методы совершенствования:
Естественный отбор –селекция.
Нормальная популяция м/о гетерогенна: «+» вариант несет желательныйпризнак», « -» - вариант не несет нужного признака.
Рис.4
Вариации обусловлены спонтанными мутациями (неконтролируемые,внезапные или причины которых не установлены). Например, высевают начашку Петри культуру жрожжей как нужный продукт, они образуют крупные имелкие колонии. Нас интересуют мелкие колонии и их пересевают, они сноваразделяются на крупные и мелкие колонии и эту операцию повторяют несколькораз. Это есть пример многоступенчатого естественного отбора. В результате упервичных колоний и колоний, получаемых после отбора обнаруживаетсяразное соотношение «+» и « -» вариантов (+80/-20) и (+60/-40).У многих м/о существует система репарации или возврата - это обратнаямутация или возврат к исходному дикому штамму. Если эта система имеетсяу м/о, то для преодоления этого явления необходимо
|
|
|
1. отбирать по нужному биотехнологическому признаку
2. отбирать по дефекту репарирования.
Индуцируемый мутагенез - путь совершенствования биообъектоврадикальными методами. К таким методам относятся:
- обработка биообъекта химическими мутагенами, нацеленными на ДНК илиДНК-тропными агентами. После этой обработки число мутантов резковозрастает, как «положительных» так и « отрицательных». При этом у частимутантов резко изменяются признаки, причем, чем больше доза мутагена, тембольше и летальных, не нужных мутантов, но одновременно и большепроцент выживших мутантов. Необходимо, чтобы сохранялся баланс междулетальными мутациями и количеством выживших мутантов.
|
|
|
1. Химические мутагены:
а) нитрозогуанидин – алкилирует основания в репликативной вилке, вызываетмутации по типу трансверсии, транзиции и делеции,
б) нитрозометилмочевина – вызывает трансверсию
в) акридиновые красители (акридиновый оранжевый) – вставка другого генамежду основаниями
г) некоторые противоопухолевые антибиотики, которые являются ДНК-тропными агентами.
2.Физические мутагены:
а) УФ- облучение, при этом образуются димеры пиридиновых оснований,идут мутации по типу транзиции и трансверсии. Изменяется порядоксчитывания генов на уровне трансляции.
б) рентгеновское облучение
в) быстрые нейтроны
г) g-лучи (Со)
д) ультразвук.
Мутационно-ступенчатый отбор – при этом отборе повышается частотамутаций. С помощью этого метода удалось добиться увеличения активностипродуцента пенициллина в 100 000 раз за счет амплификации (умножения)генов, кодирующих образование LLD- трипептида, увеличиваетсяпроизводство пенициллина, а также нарушается система ретроингибирования,повышается проницаемость стенки.
Мутосинтез и мутосинтоны представляют направление в созданииновых лекарственных средств как мутогенез. Можно привести примерполучения мутосинтонов на основе аминогликозидов, формула которыхпредставлена аминоциклитолом (устойчивая часть молекулыаминогликозида) и различными сахарами (легко изменяемая часть вструктуре молекулы). Работа заключается в том, что сначала генетикиудаляют аминоциклитол из структуры антибиотика, получая блок-мутанты,затем химики преобразуют аминоциклитол и далее биотехнологии соединяютв новую структуру антибиотика новый аминоциклитол и сахара вмультиферментных комплексах, где и происходит сборка новой молекулыантибиотика.
Цели, которые необходимо достигать биотехнологу при совершенствованиипродуцента:
1. Увеличение продуктивности в достижении большого выходалекарственных веществ на единицу биомассы.
2. Придать продуценту способность использовать менее дефицитные иболее дешевые среды.
3. Продуцент не должен ретроингибировать биосинтез конечногопродукта.
4. Устойчивость продуцента к вирусным инфекциям (бактериофагам).
5. Нетребовательность к оборудованию, т.е. биосинтез не долженснижаться при несовременной технологии оборудования (например,достижение меньшей вспениваемости культуральной жидкости)
6. Оптимизация свойств продуцента в аспекте медицинскойпромышленности (продуцент не должен иметь неприятного запаха ит.д.)
Главный тезис биотехнолога: увеличение выхода продукта наединицу биомассы продуцента.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 2524; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!