Геномика и антимикробные фармацевтические препараты
Исходя из размеров генома и количества генов понятно, что задачаполного секвенирования генома решается быстрее в случае микроорганизмов вотличие от высших эукариот. К настоящему времени полностью секвенировангеном нескольких десятков видов бактерий, в том числе патогенных. У разныхвидов бактерий размер варьирует, но в целом он близок к нескольким тысячамгенов и нескольким миллионам пар оснований, соответственно, например, уEscherichia coli - четыре с небольшим тысячи генов и четыре с небольшиммиллиона пар оснований.
Большинство генов могут рассматриваться как существенные (то есть, какжизненноважные для бактерий∗) и, следовательно, как мишени дляантибактериальных веществ.
В клинике в настоящее время используется порядка ста природных исинтетических антибактериальных веществ. Каждое из них имеет свою мишень.
Как правило, это или фермент, или рибосомный белок. Всего реализованныхмишеней также около ста. Следовательно, подавляющее количество генов вкачестве мишеней для антибактериальных агентов все еще не используются.
Для доказательства «существенности» генов применяется методизбирательного выбивания гена из генома (knockаut) с проверкой выживанияорганизма после такой процедуры.
В настоящее время представляет интерес вышеуказанная новаятехнология скрининга антибактериальных (или шире - антимикробных) агентов.
Традиционно их первичный отбор производился, начиная с испытания действияна рост тест-культуры микроорганизма.
|
|
|
Высокоактивные, подавляющие рост вещества (природные илисинтетические), отобранные на этом этапе, проходят дальнейшие испытания, вчастности, определяется антимикробный спектр их действия, их активность в
∗ Геномика позволяет установить минимальный «СЭТ» генов, достаточный, чтобы обеспечить существованиеотдельного организма. Так, сопоставляя гены микроорганизмов с маленьким геномом (0,5-0,8 мегабаз) быливыявлены 256 общих для них генов, так называемых «существенных». Из них 95 генов были включены втрансляцию, 18 - в репликацию, 9 - в транскрипцию, 23 - в метаболизм нуклеотидов. Далее, были выявленыобщие для небольшого генома гены, кодирующие белки группы шаперонов; а также гены, кодирующие белкиэнергетического и липидного метаболизма.опытах in vivo на лабораторных животных, токсичность как длямакроорганизма в целом, так и для отдельных его органов и тканей.
При благоприятных результатах, когда по завершении предклиническихиспытаний ставится вопрос о передаче препарата в клинику, обычно начинаетсяуглубленное изучение механизма его действия на субклеточном и молекулярномуровне, то есть ведется поиск его внутриклеточной мишени или, по недавноукоренившейся терминологии "таргета" (target-мишень), - макромолекулы илимакромолекулярного комплекса. Затем выявляется ген, кодирующийобразование этой макромолекулы или гены, которые кодируют образованиемакромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.
|
|
|
Новая же технология скрининга, создается на основе знания полностьюсеквенированного генома патогенна и «существенных» генов в геноме. Влабораториях, работающих в области создания новых антимикробных лекарств,предварительно выбирается ген, который будет использован для их испытаниякак таргет (точнее как таргет, будет использован продукт этого гена).
Международные базы данных позволяют получить сведения о гене и егораспространенности среди патогенов; о продукте, кодируемом этим геном; и обучастии этого продукта (как правило, фермента) в том или иномметаболическом цикле; о катализировании им конкретной реакции в цикле.
Иными словами, исходным тест-объектом для отбора антимикробных веществ,избирательных ингибиторов метаболизма, является не микробная культура, аген, или точнее, кодируемый им продукт.
Таргетный скрининг и его технология
Таргетный скрининг позволяет в соответствии с выбором гена вести отборбиологически активных веществ, в частности, антимикробных препаратов сзапланированным иным механизмом действия в отличие от традиционногометода (поиск, ведущийся методом от клетки к гену).
|
|
|
Первый этап таргетного скрининга начинается с выделения этого гена(соответствующего фрагмента ДНК) из генома. Далее, используя полимеразнуюцепную реакцию (ПЦР), фрагмент ДНК амплифицируется. Количество копийгена умножается. Конструируются:
1) бесклеточная система, где наработанная матрица служит для полученияинформационной РНК, специфичной для гена;
2) бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служитдля наработки белкового продукт, кодируемого данным геном.
Следует отметить, что методика ПЦР, а также методы получениябесклеточных систем транскрипции и трансляции в настоящее время достаточнохорошо отработаны и в значительной мере автоматизированы.
Бесклеточная система, непосредственно используемая для испытания,первичного отбора и оценки активности потенциальных лекарственных веществ- ингибиторов фермента, (продукта изучаемого гена), содержит этот продукт иего субстрат (субстраты).
|
|
|
Когда наработан белок (продукт избранного для изучения гена), тогдавозникает вопрос, как узнать функцию этого белка? Например, какую реакциюон катализирует как фермент, для того, чтобы по подавлению этой реакцииотбирать ингибиторы. Если имеется близкое сходство белка с белком из"модельного" организма, подобрать бесклеточную систему - субстрат длянового белка, не является трудной задачей.
Если сходство есть, но не очень близкое, прибегают к анализу "мотивов" -коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределеныпо всей длине белковой цепи при выравнивании и могут оказаться сходными удвух белков. Когда такого сходства нет, или сходство обнаружено, но нетясности в функции самого гомолога, то есть белка, взятого для сравнения, топрибегают еще к одному пути установления функций изучаемого белка.
Устанавливают, с какими белками он контранскрибируется. Если транскрипт -часть полицистронной информационной РНК, необходимой для протекания впоследующем определенного метаболического процесса с участием несколькихферментов, тогда поиск функции изучаемого белка, включенного в группу этихферментов, сужается.
В целом подходы к установлению функций продуктов изучаемых геновмногочисленны и их разнообразие неуклонно растет. Таким образом, можно, вконечном счете, проводить серийные испытания потенциальных ингибиторовфункций почти любого из тысяч генов, составляющих геном патогена иобнаруживать все возможные "уязвимые точки" микробной клетки.
Подобный путь достижения цели породил в литературе термин "обратнаягенетика" - исследование ведется не от клетки и ее фенотипа к гену и геному, а,наоборот, от гена к клетке, и к ее фенотипу. Что касается скринингалекарственных веществ, осуществляемого таким путем, то он получил название"таргетного скрининга" или «скрининга по мишени».
Таргетный скрининг и его технология, схематически описанная выше,широко обсуждается в настоящее время. Неоспоримое достоинство в том, чтолюбой ген становится доступен для ингибиторов его функций.
Однако, в отношении таргетного скрининга высказываются и критическиезамечания, которые не носят принципиального характера. Однако, в нихотмечается, что обнаружение ингибитора таргета – это только начало путисоздания антимикробного агента, пригодного для клиники. Требуется,например, чтобы это вещество проникало через оболочку микробной клетки, неподвергалось ферментативной инактивации и т.п. Тем не менее, таргетныйскрининг с некоторыми его модификациями и дополнительными тестами,начинает занимать важное место в создании антимикробных лекарств.
Полное секвенирование генома в сочетании с применением методовгенетической инженерии как достижение структурной геномики, вносит свойсклад в фармацию еще в одном отношении. У патогенных микроорганизмовоткрыты гены, «существенные» для протекания инфекционного процесса, но не«существенные» при росте in vitro - на искусственных питательных средах. Впоследнем случае они ускользают от внимания исследователя, не поддаютсяидентификации и не могут быть использованы как таргеты при поиске лекарств.
После того, как эти гены были отдифференцированы - такая возможностьпоявилась. То есть, возможность наработки, согласно описанной вышепроцедуре, ДНК-матрицы, соответствующей информационной РНК, затемнаработка генного продукта и, наконец, отбора ингибиторов функций этогогенного продукта.
Скрытые или по образному выражению "молчащие" in vitro геныпатогенных микроорганизмов получили название ivi генов (геноввирулентности), несмотря на то, что в их число входят не только гены,кодирующие образование токсинов, адгезинов и других фактороввирулентности. К ним относят также гены ферментов и транспортных белков,позволяющих патогенной микробной клетке жить и размножаться в тканяхмакроорганизма в условиях дефицита некоторых органических веществ инеорганических ионов. Можно привести такой пример: микробная клетканаходясь in vivo, испытывает недостаток ионов железа, чего не бывает наобычных питательных средах. В этом случае в клетке синтезируется специальнаясистема транспорта железа в клетку из среды с малой его концентрацией;фактически транспорт идет против градиента концентрации. Для образованиятакой системы необходима экспрессия определенных генов. Из молчащих(«несущественных») они становятся «существенными», то есть подавление ихфункций отобранными ингибиторами приведет к подавлению роста(размножения) патогена именно в условиях in vivo, т.е. в инфицированноморганизме. Это, собственно, и есть цель исследователей, создающих новыелекарственные препараты.
К числу генов, становящихся «существенными» для патогена именно invivo относятся гены, кодирующие оптимальный компонентный состав системы,а также недостаток в пуринах и их предшественниках.
Вышеизложенное, конечно, не означает, что во время инфекции в клеткепатогена экспрессируются только ivi гены. Большинство генов экспрессируетсяи in vivo и in vitro. Их продукты необходимы клетке всегда. Такие гены получилиобразное название "house keeping gens", что означает, "гены, на которыхдержится дом". Эти гены экспрессируются в любых условиях, поскольку без нихклетка просто не может существовать.
Соотношение между house keeping gens и ivi gens у разных патогенныхбактерий варьирует, но более 90% генов принадлежит к первой группе.
Поскольку ингибиторы house keeping gens обнаруживаются при поиске на питательных средах in vitro, практически все применяемые в клиникеантибиотики и синтетические антибактериальные препараты являютсяингибиторами функций именно этих генов.
Гены, кодирующие эти защитные ферменты не относятся к house keepinggens. При этом, ингибиторы беталактамаз сами почти не обладаютантибактериальной активностью и применяются вместе с беталактамнымиантибиотиками. Последние, в свою очередь, ингибируют активностьтранспептидазы пептидогликана, гена принадлежащего к house keeping gens.
Таким образом, ivi гены (их продукты) составляют набор таргетов дляиспользования их только в будущем. Также представляют значительныйинтерес пути выявления и выделения ivi генов с последующим ихиспользованием в бесклеточных системах отбора ингибиторов. Работы в этомнаправлении ведутся в ряде лабораторий. В качестве примера приведем одну изтаких работ. Ее авторы назвали свой метод IVET - данная аббревиатура означаетIn Vivo Expression Technology.
Геном патогенной бактерии (в данном случае речь идет о штаммеSalmonella typhi murium) с помощью большого набора рестриктаз делится насотни фрагментов. Каждый отдельный фрагмент генно-инженерными методамисоединяется с лишенным промотора геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы.
Такой, лишенный промотора ген, не может реплицироваться при его введении вклетку. Однако, он мог реплицироваться, если соединенный с ним ген
∗ В клинике применяются ингибиторы беталактамаз (сульбактам, клавулановая кислота и др.). (подразумевается, что это фрагмент ДНК- салмонеллы) имел бы промотор длясвоей репликации.
Тогда, этот промотор, вызвал бы репликацию не только своего гена, но ирепликацию следующего за ним гена, хотя и не имеющего промотора. Такимобразом, репликация гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы моглапроисходить в клетке, только за счет использования или "захвата" чужогопромотора.
На следующем этапе работы к этому сдвоенному фрагменту,(обозначенному x-cat, где x - фрагмент генома салмонеллы, а cat – генхлорамфеникол-ацетилтрансферазы; далее присоединяется также лишенныйпромотора лактозный оперон (lac Z). Этот оперон нужен для системы окислениялактозы; в результате, генные инженеры получали фрагмент уже из трех частей:x-cat - lacZ. И этот фрагмент состоящий из трех разнородных частей, включалсяв плазмиду. Фактически в данном случае надо говорить, не об одном фрагменте,а о многих фрагментах, так как часть х, происходящая из генома салмонеллы,зависит от использованной рестриктазы и поэтому содержит разные участкигенома.
Фрагменты x-cat - lacZ различаются именно по х. В результате, получилсянабор различных плазмид, а после введения их в клетку E.coli - набор различныхштаммов E.coli с разными частями генома салмонеллы.
Следующий этап работы заключался во внедрении E.coli в организмлабораторного животного (мыши) и введении животному хлорамфеникола.
Спустя сутки из ткани животного высевалась бактериальная культура, причемвысев производился на твердую индикаторную среду с лактозой.
Анализировались (визуально) выросшие колонии. Они оказывались или красногоцвета (окисляющие лактозу, меняющие рН) или - белого (бесцветные). Красныедоминировали, их было свыше 90%. Однако, отбирались и подвергалисьдальнейшему изучению именно белые. Ход рассуждений в данном случае былследующим. Если из животного, которому ввели хлорамфеникол высеяласьжизнеспособная клетка, давшая колонию на твердой среде, значит в этой клеткеэкспрессировался ген хлорамфеникол- аетилтрансферазы и образовывался,соответственно, фермент, инактивирующий (ацетилирующий) антибиотик.
Следовательно, в данном фрагменте х - есть ген с промотором. Этот генэкспрессировался в организме животного, а вслед за ним экспрессировался и генхлорамфеникол-ацетилтрансферазы (лишенный, напомним, собственногопромотора). Но, экспрессироваться мог ген, принадлежащий как к ivi генам, такикhousekeepinggens. Однако, это еще не позволяет "поймать" ivi ген иутверждать, что в фрагменте х именно один из таких генов. Если, колония наиндикаторной среде с лактозой выросла бесцветная, значит на искусственнойпитательной среде, данный промотор не работал и ген во фрагменте х неэкспрессировался. Вероятно, что он нужен только при развитии инфекционногопроцесса и принадлежит к генам вирулентности. В случае же колоний красногоцвета экспрессируется ген, кодирующий образование фермента, расщепляющеголактозу; при этом меняется цвет индикатора и колония окрашивается. Отсюдаможно сделать вывод о том, что в данном фрагменте х содержится (вместе спромотором) ген, принадлежащий к house keeping gens, т.е. он экспрессируетсявсегда: и в организме животного и на искусственной питательной среде. Такойген в данной случае не представляет интереса. Его можно обнаружить болеетрадиционным путем (для подбора в последующем ингибиторов кодируемогоим продукта).
Авторы рассмотренного метода (метода IVET) приводят результатыконкретной серии своих экспериментов, в соответствии с которой, на 212.000колоний красного цвета пришлось только около 2600 колоний неокрашенных. Изклеток E.coli, образовавших эти, последнего типа колонии, было затем выделенооколо ста генов, принадлежащих к "скрытым" генам салмонеллы (ivi генам). Изних около пятидесяти были новыми, т.е. ранее не описанными, и их продуктыпредставляли интерес как потенциальные таргеты для отбора антимикробныхагентов.
Метод IVET не является единственным путем идентификации ivi генов упатогенных микроорганизмов. Разрабатываются и другие подходы, например, сиспользованием направленного мутагенеза.Интерес к ivi генам обусловлен не только тем, что они (их продукты)практически не использованы как таргеты, но и тем, что здесь следует надеятьсяна высокую избирательность действия (безопасность) создаваемыхлекарственных средств. В месте с тем необходимо отметить, что в настоящеевремя геномика уже позволяет дифференцировать гены патогенныхмикроорганизмов по многим показателям и это, в свою очередь, позволяет вестискрининг антимикробных агентов все более целенаправленно. В качествепримера можно привести результаты, полученные при изучении представителейрода Chlamydia ( внутриклеточных паразитов с относительно небольшимгеномом - порядка одного миллиона пар нуклеотидов), которые вызываютинфекции бронхолегочного и мочеполового трактов. Прежде всего гены этогопрокариота были разделены на house keeping gens и ivi гены. Далее, былавыявлена группа генов, влияющих на апоптоз клетки - хозяина. Далее, былиидентифицированы гены, дублирующие систему жизнеобеспечения паразита.
При этом было показано, что ряд этих генов близок по степени гомологии генамвысших растений и приблизительно 27 % из них уникальны для рода Chlamydia.
Классификации различных генов становятся все более многочисленнымии разнообразными, а, следовательно, и таргетный скрининг, начинающийся сгенов, в идеале должен вести к все более четким результатам, то естьантимикробным агентам с четко определенными свойствами.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1501; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!