Этапы изготовления гистопрепаратов и техники микроскопирования
Подготовка гистологического материала
и приготовление парафиновых срезов
1. Фиксировать небольшие (0,5 х 0,5 х 1,0 см) кусочки органов в 10% водном растворе формалина (или жидкости Буэна: 15 объемов насыщенного водного раствора пикриновой кислоты + 5 объемов формалина + 1 объем ледяной уксусной кислоты ) - 24 часа. (Величина кусочка не должна превышать указанную, так как фиксатор за сутки проникает на глубину не более 0,2 см. Объем фиксатора должен превышать объем кусочка в 30-50 раз).
2. Промыть кусочки в проточной воде — 24 часа.
3. Обезводить кусочки (и частично уплотнить) в спиртах возрастающей крепости — 70°, 80°, 90°, 96° и 100° (в зависимости от характера материала от 6 до 24 часов).
4. Выдержать в ксилоле - 2 часа (в хлороформе - 24 часа) - это связано с тем, что парафин не соединяется со спиртом.
5. Выдержать в насыщенном растворе ксилола (или хлороформа) с парафином при температуре 37 °С (в термостате) - 2 часа (можно до суток), чтобы избежать большого перепада температур.
6. Выдержать в чистом парафине (или содержащем до 5% пчелиного воска) при температуре 56-60 °С.
7. Залить материал парафином в бумажных или металлических формочках. Охладить в воде.
8. Вырезать кусочки и наклеить на деревянные кубики.
9. Изготовить тонкие (5-6 мкм) срезы на микротоме (санном или роторном).
10. Поместить срезы на предметные стекла, смазанные яичным белком с глицерином.
11. Расправить срезы на капле дистиллированной воды при легком подогревании.
|
|
|
12. Подсушить срезы в термостате при температуре 37 "С
Окрашивание срезов гематоксилин-эозином
1. Депарафинировать в ксилоле — 2 мин.
2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).
3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-3(mhh.
4. Срез поместить в водопроводную воду на 5— 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).
5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.
6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5 - I мин в каждой.
7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по I мин в каждом (лучше капать из капельницы).
8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле - I мин.
9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.
10. Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.
После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.
Помимо этого классического и наиболее широко распространенного метода существует большое количество других методов для выявления различных клеточных и тканевых структур, а также цито- и гистохимические методы.
|
|
|
Контрольные вопросы
1. Сходства и различия световой и электронной микроскопии. Разрешающая способность и увеличение.
2. Сущность фиксации и механизм действия фиксаторов. Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
3. Преимущества и недостатки трех способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, замораживание.
Рис. 1 Микроскоп типа МБИ-1.
Лабораторная работа №2
Тема: Клеточные и неклеточные компоненты тканей
Цель:Познакомиться с неклеточными структурами (синцитием, симпластом, волокнами), а также со строением животной клетки; научиться различать эти структуры и находить их под микроскопом.
Материалы и оборудование:Наборы препаратов «Цитология», «Соединительные ткани», «Мышечные ткани»; микроскопы.
Содержание:
1.Изучить и зарисовать строение синцития с препарата ретикулярной ткани или мезенхимы зародыша курицы.
2.Изучить и зарисовать симпласт по препарату поперечно-полосатой мышечной ткани.
3. Изучить и зарисовать различные волокна (неклеточные формы живой ткани) по препарату рыхлой соединительной ткани.
4. Изучить и зарисовать строение животной клетки на примере препарата клеток печени аксолотля.
|
|
|
Общие указания
При исследовании цитологических препаратов в начале нужно сделать общий обзор препаратов (ок. 15, об. 10). Выбрав нужное место, центрировать препарат и перевести на большое увеличение (ок. 15, об. 40). Зарисовки производить только на большом увеличении.
Препарат №1. Мезенхима. Зародыш курицы. Синцитий (рис. 63 Г).
Найдите под малым увеличением и поставьте под большое один из наиболее светлых участков препарата. Это и будет мезенхима. На рисунке отметьте характерную форму удлинённых клеток с отростками, их бледные ядра, синцитиальное строение этой ткани, обратите внимание на присутствие в ней обособленных клеток. Мезенхима заполняет все пространства между остальными структурами зародыша.
Препарат №2. Ретикулярная ткань. Лимфатический узел кошки (рис. 29 Г-Э). Синцитий.
Найдите при малом увеличении светлый участок основной ткани лимфатического узла и рассмотрите его.
Вы увидите здесь одноядерные клетки, связанные своими протоплазматическими отростками в единый комплекс или соклетие, т.е. синцитий.
Более детально структуру клеток, их ядер и характер связи между ними покажет большое увеличение.
Зарисуйте часть препарата, выделив клетки и основное вещество. Покажите связи между клетками.
|
|
|
| Рис. 1. Мезенхима. Зародыш курицы. Синцитий. | Рис. 2. Ретикулярная ткань. Лимфатический узел кошки. |
Препарат №3. Симпласт. Мышцы языка кролика (рис. 30) (Г-Э или Ж.Г.).
Найдите при малом увеличении светлый участок с продольно разрезанными мышечными волокнами.
В каждом волокне при большом увеличении вы разглядите пучок тончайших нитей. Миофибриллы – это сократительный аппарат волокна. В каждом волокне вы найдёте много ядер, однако не найдёте отдельных клеток, т.е. мышечное волокно представляет собой единую протоплазматическую массу без признаков расчленения на отдельные клеточные образования. Такая структура называется симпластом.
Нарисуйте несколько волокон, показав их симпластическую организацию.
| Рис.3. Симпласт. Мышцы языка кролика. |
Препарат №4. Рыхлая соединительная ткань. Подкожная клетчатка крысы (рис. 64) (Ж.Г.).
При малом увеличении найдите тонкие места и рассмотрите их на большом увеличении. Рыхлая соединительная ткань состоит из 2-х компонентов: неклеточного аморфного бесструктурного промежуточного вещества с волокнами и различных клеток. Основное промежуточное вещество рисуется в препарате в виде голубоватой или сероватой полупрозрачной плёночки.
Волокна бывают двух родов: коллагеновые и эластические. Первые представляют собой извитые ленты различной длины. Они никогда не ветвятся. Они складываются из отдельных тонких волоконец – фибрилл, склеенных по длине между собой. Эластические волокна ветвятся, образуя в местах ветвления своеобразные треугольники. Волокна могут быть любой толщины – от тонких тяжей до массивных плёнок. В неокрашенном препарате они блестят и сильно преломляют свет.
Между этими волокнами находятся разнообразные клетки, выполняющие определённую функцию. На них сейчас не стоит обращать внимание.
На рисунке отметьте, какие волокна увидели.
Препарат №5. Общая морфология животной клетки. Печень аксолотля (рис. 1) (Г-Э).
Клетки печени аксолотля довольно крупные, несколько угловатые по форме. Под малым увеличением необходимо выбрать 2-3 клетки, у которых хорошо видна оболочка, ядро. Следует обратить внимание на структуру цитоплазмы.
Обозначить Цитоплазму, ядро, ядрышко, хроматин.
Ядрышко отличается от глыбок хроматина более округлой формой.
| Рис. 4. Рыхлая соединительная ткань. Подкожная клетчатка крысы. | Рис. 5. Общая морфология животной клетки. Печень аксолотля. |
Задания
1.Синцитий – это ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.Симлласт – это ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3.На занятии рассмотрели следующие волокнистые структуры ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4.Волокнистые структуры рассмотрели на примере препаратов ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
5.К клеточным компонентам тканей относятся __________________________________________________________
6.К неклеточным компонентам тканей относятся ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
7.Клетка – это ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
8.Ткань – это ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
9.Гистогенез – это ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
10.Межклеточное вещество – это ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
11. Симпласт рассмотрели на примере препарата ________________________________________________________________________________________________________________________________________
12.Синцитий рассмотрели на примере препаратов ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Лабораторная работа №3
Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 662; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!