Высушивание и фиксация мазков препаратов
Изготовленные мазки высушивают при комнатной температуре или в термостате. Тонкие мазки быстро высыхают на воздухе, более толстые можно высушивать над пламенем горелки или спиртовки. Предметное стекло при этом держат пинцетом (или за ребра 1-м и 2-м пальцами правой руки) мазком кверху. Чтобы не допустить денатурации белков бактерий и нарушения их внутренней структуры степень нагревания контролируют, прикасаясь к тыльной стороне ладони – должно ощущаться легкое чувство жжения.
Высушенные препараты необходимо фиксировать к поверхности стекла. Для того, чтобы убить и закрепить бактерий на стекле, предотвратив их смывание в процессе окраски. К тому же убитые микроорганизмы значительно лучше окрашиваются, а также не представляют опасности для работающих.
В лабораторной практике самым распространенным методом фиксации мазков является фламбирование - то есть фиксация в пламени газовой горелки или спиртовки. При этом мазок держат так же, как при высушивании и трижды проводят его через пламя. Весь процесс фиксации длится 5-6 с, а действие температуры - 2 с. Более длительная фиксация уменьшает качества препарата, а недофиксированный мазок при следующей обработке смывается и таит в себе опасность заражения.
При изучении некоторых структур микробных клеток, а также мазков крови, отпечатков органов, которые деформируются при высокой температуре фиксируют химическим способом, при помощи одной из фиксирующих жидкостей: этанолом (на протяжении 10-15 мин), метанолом (5 мин), ацетоном (5 мин), смесью Никифорова (10-15 мин), парами формалина или осмиевой кислоты (несколько секунд). При такой осторожной фиксации значительно лучше сохраняются и просмотриваются все структуры клеток и бактерий.
|
|
|
Окраска препаратов
Существуют простые и сложные методы окраски. При окраске простым методом используется только один краситель, позволяющий отличить клетки от неокрашенного фона, Простой метод окрашивания дает возможность исследовать общую морфологию микробов, их размеры, форму, количество, локализацию, взаимное расположение клеток и т. п.. Но с его помощью невозможно изучать внутреннюю структуру бактерий и их разное отношение к нескольким красителям.
Простым окрашиванием называют такое, при котором применяют лишь один краситель. Чаще всего используют основной разведенный фуксин Пфейффера и щелочную метиленовую синьку Леффлера. Фуксином красят 1-2 мин, а синькой 3-5 мин. Препараты, которые содержат, кроме бактерий, тканевые и клеточные элементы макроорганизма, лучше окрашивать метиленовой синькой, которая красит фон препарата сравнительно слабо, а бактерии значительно интенсивнее.После истечения времени окрашивания препарат промывают дистиллированной водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем мазки высушивают на воздухе или между листами фильтровальной бумаги и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива.
|
|
|
При окраске сложным методом используют несколько последовательно наносимых красителей, фиксатор и проявитель (окраска по методу Грама и др.).
ЧАСТЬ 2
Различия в окраске по Граму связаны с некоторыми особенностями строения клеточной стенки бактерий. В однослойной клеточной стенке грамположительных микробов имеется несколько рядов пептидогликана (до 80 % от массы клеточной стенки), поры которого при обработке этиловым спиртом сужаются и препятствуют выходу комплекса, образуемого при взаимодействии красителя генцианового фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода, входящего в состав люголя. Также в поверхностном слое клетки находится магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основным красителем – генциановым фиолетовым. Поэтому грамположительные микробы прочно удерживают первый наносимый краситель – генциан-виолет и окрашиваются в фиолетовый цвет.
|
|
|
У грамотрицательных микроорганизмов имеется двуслойная клеточная стенка. Во внутренний слой входят всего один-два ряда пептидогликана. Верхний слой представлен наружной мембраной, включает фосфолипиды, белки и липополисахарид (ЛПС). Отсутствует магниевая соль рибонуклеиновой кислоты. В связи с этим не образуется прочного соединения компонентов клеточной стенки с основным красителем. Они легко обесцвечиваются этиловым спиртом. Поэтому клетки бактерий окрашиваются в цвет последнего наносимого на их поверхность красителя (водный фуксин) – в красный.
Техника окраски по Граму:
1. Фиксированный мазок кладут на рельсы и накрывают бумажкой по Синеву с генцианфиолетовым, заливают ее водой или наливают на мазок генциан-виолетом через фильтровальную бумагу. Экспозиция 2 мин.
2. Снимают бумажку и наливают раствор Люголя на 1 -2 минуты.
3. Сливают Люголь в кювету, на мазок наливыют с 96˚ этиловый спирт до прекращения отхождения «струею» красителя, примерно 10-15 сек.
4. Промывают проточной водой, стряхивают воду.
5. Наносят фуксин Пфейффера.Экспозиция 2 мин.
5. Промывают проточной водой и сушат в вертикальном положении.
6. Микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Отличительные признаки
Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 2050; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!