Инсулин. Источник получения. Видовая специфичность
Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии. Протопластирование и слияние протопластов микроорганизмов и растений. Получение новых гибридных молекул в качестве целевых продуктов. Протопластирование и "активация молчащих генов". Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений: - невысокая производительность, - можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом, - трудоемкость и длительность. Другой метод выделения протопластов энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrotheciumverrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом. Преимущества знзиматического метода по сравнению с механическим: - одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток), -клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу, -клетки не повреждаются, -метод сравнительно быстрый. Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток. Выделение протопластов проводят в три этапа: -обработка ферментами, -выделение протопластов из клеточных стенок, - отделение интактных протопластов от клеточных осколков. Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotianatabacum: Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 -80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помешают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев. Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры. Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (СаСl2, КСl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта. Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15°. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация. При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования. Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 - 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно. Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны. Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28°С, невысокая освещенность (не более 2000 лк). Способы культивирования протопластов Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г. Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45°С. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28°С. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост. Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами. На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: - видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения, - способ и условия выделения протопластов, - плотность высева протопластов, - состав питательной среды. Слияние протопластов - парасексуальная гибридизация Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить: - скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов), - получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого, - слияние трех и более клеток, - получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей, - перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение, - получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др. Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегации генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов. Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических. При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2 - 3 протопластов, либо цепочки из 5 - 6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов. В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт. Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ - высокие значения рН высокая концентрация Са2+ “, которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са2+ 100 - 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой. При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов. Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции - желто-зеленый и красный. Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году. Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной: 1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений. 2.Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов. 3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток. Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984). При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды - продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы. Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут быть выращены растения - рег
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Инсулин. Источник получения. Видовая специфичность.
Инсулин (insula-остров)– белок, вырабатываемый в β-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Его строение детально изучено. Инсулин явился первым белком, полученным путём химического синтеза. В 1926г. Были разработаны способы выделения инсулина в высокоочищенном состоянии, в том числе в виде кристаллических препаратов, содержащих 0,36% цинка. Молекулярная масса кристаллического инсулина равна 36кДа. Его молекула представляет собой мультимер, составленный из шести протомеров и двух атомов Zn. Протомеры образуют димеры, которые взаимодействуют с имидазольными ядрами радикалов гис10 цепи В и способствуют их агрегации в гексамер. Распадаясь, мультимер даёт три субчастицы с молекулярной массой 12 кДа каждая. В свою очередь, каждая субъединица расщепляется на два протомера с молекулярной массой 6 кДа. Все перечисленные модификации инсулина – протомер, димер и гексамер – обладают полной гормональной активностью. Поэтому часто молекулу инсулина отождествляют с протомером, тем более, что в физиологических условиях инсулин существует в мономерной форме. Дальнейшее фрагментирование молекулы инсулина на цепь А (21 аминокислотный отстаток) и цепь В (30 аминокислотных остатков) ведёт к утрате гормональных свойств. Введение инсулина путём инъекции или внутрь в виде препарата, инкапсулированного в липосомы, вызывает: понижение содержание глюкозы в крови, повышение запасов гликогена в мышцах, усиление анаболических процессов, нормализацию минерального обмена. Инсулиновый рецептор (ИР) представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц (α и β), соединённых в конфигурацию α2β2 и связанных между собой дисульфидными мостиками. ИР постоянно синтезируется и распадается. Его период полужизни составляет 7-12 часов.
Первые препараты инсулина получали путём кислотно-спиртовой экстракции из поджелудочных желёз крупного рогатого скота. Бычий инсулин отличается от человеческого тремя аминокислотами, и выпуск его прекращён из-за большого числа осложнений и аллергических реакций. К развитию осложнений свиной инсулин приводил реже, т.к. отличается по структуре от человеческого одной аминокислотой, но его использование также практически прекращено. Препаратами выбора в настоящее время являются человеческие инсулины.
Для получения человеческого инсулина, применяемого в настоящее время, используют два метода:
· Полусинтетический – с помощью ферментно-химической замены В30 аминокислоты аланина в свином инсулине треонином получают полусинтетический человеческий инсулин;
· Биосинтетический метод – с помощью генно-инженерной технологии участок генома человека, ответственный за синтез инсулина, ассоциируют с геномом Escherichia coli или дрожжевой культуры, в результате чего последние начинают продуцировать генно-инженерный человеческий инсулин.
Полный химический синтез и экстракция из поджелудочных желёз человека как методы синтеза инсулина не применяются из-за неэкономичности технологии.
С 1996г. в нашей стране применяют т.н. аналоги инсулина. Эти инсулины структурно отличаются от молекулы естественного инсулина. Перестраивание аминокислотной последовательности в цепи инсулина привело к изменению биологических свойств, скорости всасывания из подкожно-жировой клетчатки, профилю действия данных препаратов. Как следствие – изменение режимов введения инсулина по отношению к приёму пищи и улучшение контроля сахарного диабета 1 типа.
На сегодняшний день выпуск и применение инсулинов животного происхождения в развитых странах мира практически прекращены. Сейчас всё больше накапливается фактов о том, что через субстанции из органов животных человеку передаются болезни, в частности вирусные. По рекомендации ВОЗ, Американской диабетической ассоциации (АДА) для лечения всех больных диабетом, требующих инсулинотерапии, целесообразно применять инсулины человека генно-инженерного или биосинтетического происхождения.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 987; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!