Идентификация выделенных других (неполио) энтеровирусов
Идентификацию выделенных штаммов НПЭВ проводят в реакции нейтрализации инфекционности на культуре клеток микрометодом.
Используют смеси иммунных к энтеровирусам сывороток, которые распространяются ВОЗ для лабораторий, включённых в Глобальную лабораторную сеть по диагностике полиомиелита, позволяющие определить принадлежность выделенного вируса к полиовирусу, группе вирусов Коксаки В1-6, идентифицировать 20 серотипов вирусов ЕСНО и вирус Коксаки А9. Могут быть использованы антисыворотки к НПЭВ, зарегистрированные и разрешённые в Российской Федерации к применению в установленном порядке. Подготовку рабочих разведений сывороток/смесей сывороток проводят в соответствии с инструкциями производителя.
Проведение теста микронейтрализации, интерпретацию результатов выполняют в соответствии с «Руководством по лабораторным исследованиям полиомиелита», (4-е издание, ВОЗ, 2005).
Типирование выделенного вируса проводят на той культуре, на которой он выделен.
Выделенные штаммы НПЭВ и исходные образцы фекалий, из которых они были выделены, в течение 7 дней после идентификации направляют в НЦ для проведения подтверждающих исследований. При выявлении смеси полиовируса и НПЭВ в НЦ отправляют неразделённую смесь или разделённые штаммы для подтверждения результатов и ВТД полиовируса.
Внутритиповая дифференциация полиовирусов
ВТД полиовирусов выполняет НЦ, используя для этого два метода, рекомендованные и поддерживаемые реагентами ВОЗ:
|
|
|
1) метод иммуноферментного анализа с использованием перекрёстно адсорбированных антисывороток
2) метод диагностической ПЦР.
ВТД должна быть проведена в течение 14 дней от момента получения из РЦ или выделения и идентификации штамма в НЦ. Каждый штамм должен быть исследован двумя методами ВТД.
Проведение и интерпретация результатов тестов выполняется в соответствии с «Руководством по лабораторным исследованиям полиомиелита», (4-е издание, ВОЗ, 2005). В случае получения противоречивых результатов двух методов ВТД, указывающих на принадлежность штамма полиовируса к дикому, вакцинородственному, присутствие в пробе смеси дикого и вакцинного вируса одного типа, НЦ в течение 7 дней от момента получения результатов должен начать проведение частичного секвенирования участка генома VP1 этого штамма полиовируса.
Сроки хранения материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом ОВП, а также от лиц общавшихся с ними
Все образцы фекалий от больных ПОЛИО/ОВП, а также от лиц общавшихся с ними, хранят при температуре минус 200С в течение 12 месяцев от момента поступления в лабораторию.
|
|
|
Экстракты образцов фекалий хранят при температуре минус 200С в течение 3 месяцев от момента подтверждения результата исследования в НЦ.
Изоляты полиовирусов/НПЭВ хранят при температуре минус 200С в течение 3 месяцев от момента подтверждения результата исследования в НЦ и получения результатов ВТД.
После истечения срока хранения материалы уничтожаются автоклавированием в установленном порядке.
Выявление и титрование нейтрализующих антител к полиовирусу.
Выявление специфических антител к полиовирусу в сыворотках больных ПОЛИО/ОВП проводят с диагностическими целями в реакции нейтрализации инфекционности микрометодом. Порядок отбора, хранения, направления для исследования парных сывороток изложен в пп. 3 и 4 настоящих МУ.
В основе определения титров антител с помощью реакции нейтрализации лежит принцип взаимодействия известного вируса с гомологичными антителами, присутствующими в сыворотке, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток.
Для реакции нейтрализации с целью выявления антител к полиовирусу используют клетки НЕр-2 (Cincinnati).
В качестве известного вируса с известным титром используют только вакцинные штаммы Сэбина вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3 (референс-штаммы). Предварительно готовят рабочие запасы референс-штаммов, используя для пассажа штаммы, полученные в НЦ (выполняют не более 3-х последовательных пассажей на культуре клеток НЕр-2 при температуре 360С). Рабочие запасы референс-штаммов разливают на аликвоты, достаточные для проведения одного опыта, в пластиковые флаконы с завинчивающейся крышкой, тщательно маркируют и хранят при температуре от минус 200С до минус 700С. До постановки опыта нейтрализации определяют титр референс-штаммов (Приложение 5), исходя из которого рассчитывают рабочее разведение вируса каждого типа так, чтобы в 50 мкл вируссодержащей жидкости содержалось 100 ТЦД50 (допускаются колебания в интервале 50-200 ТЦД50).
|
|
|
В каждый опыт включают контрольное титрование лабораторной референс-сыворотки, т.е. сыворотки с известным уровнем нейтрализующей активности. Такая сыворотка обычно представляет собой смесь сывороток взрослых людей, недавно иммунизированных бустер-дозой оральной полиовирусной вакциной. Сыворотку разливают на аликвоты, которые хранят при температуре минус 200С.
Работают с сыворотками в резиновых перчатках в БЗУ 2 класса безопасности.
|
|
|
Проведение реакции нейтрализации для выявления антител к полиовирусу изложено в Приложении 6, рис.2.
Обеспечение биологической безопасности при проведении вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича
В постсертификационный период, во избежание попадания дикого полиовируса в человеческую популяцию из лаборатории, для предупреждения внутрилабораторной контаминации необходимо обеспечить биологическую безопасность работы и хранения полиовируса и потенциально инфицированных им материалов. Для этого все работы должны выполняться в соответствии с требованиями нормативных и методических документов. Лаборатории, которые проводят исследования материалов от больных ПОЛИО/ОВП, должны иметь разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. При работе выполняются требования качественной микробиологической техники («Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита» 4-е издание, ВОЗ, 2005.)
1. Доступ посторонних лиц в лабораторию ограничен. К работе допускаются сотрудники, только полностью иммунизированные против полиомиелита.
2. Работа в лаборатории проводится в лабораторной защитной одежде и лабораторной обуви с закрытыми носками.
3. Все перечисленные работы проводятся с полным соблюдением мер безопасности: регистрация проб, обработка проб, работа с пипетками, отделение сыворотки крови от сгустка, использование центрифуг, гомогенизаторов, встряхивателей, ультразвуковых и механических измельчителей ткани, холодильников, хранение инфекционных материалов, вскрытие ампул с инфекционным материалом, пересылка и транспортирование клинических проб и проб с инфекционным материалом.
4. В лаборатории запрещается приём пищи и питья, курение. В лабораторных помещениях и в каких-либо хранилищах, где могут находиться инфекционные материалы, запрещается хранение пищи и питья.
5. Первичная обработка материала, заражение культур клеток, работы, связанные с использованием выделенных штаммов вирусов, серологические исследования проводят в резиновых перчатках в БЗУ 2 класса безопасности.
6. В каждом вирусологическом боксе должны быть инструкции по проведению каждого вида работ. Все приборы – центрифуги, БЗУ 2 класса защиты и пр., должны иметь инструкции по работе с ними.
7. Контейнеры из-под первичного материала, использованная одноразовая посуда, наконечники микропипеток, микротитровальные планшеты, пипетки и пр. во время проведения работ собирают в пластиковые пакеты, предназначенные для автоклавирования. После окончания работ – обеззараживают автоклавированием. Стеклянную посуду помещают в 6% раствор перекиси водорода.
8. Обеззараживание рабочих поверхностей, оборудования проводят дезинфицирующими средствами с вирулицидной активностью, не содержащими хлора, и последующей обработкой ультрафиолетом в течение 30-60 минут.
9. Потенциальные источники дикого полиовируса для снижения риска случайного инфицирования сведены к минимуму следующим образом:
- использование дикого полиовируса прекращается во всех случаях, где ту же задачу можно выполнить при помощи аттенуированных вакцинных штаммов, инактивированных антигенов или НПЭВ;
- во всех случаях, когда нет программной или научной необходимости хранения полиовирусов, все запасы таких вирусов и потенциально инфицированных ими материалов, следует уничтожить автоклавированием или сжиганием.
10. Лаборатории, сохраняющие дикие полиовирусы, должны выполнять следующие требования:
- если дикие полиовирусы необходимы для проведения исследований, то используют только штаммы, которые могут быть легко идентифицированы молекулярными методами;
- все виды работ с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными дикими полиовирусами, проводят в БЗУ 2 класса безопасности;
- холодильники/морозильники, в которых хранят дикие полиовирусы, запираются (доступ к ключам ограничен), чётко маркируются, как хранящие такие вирусы;
- инвентарные списки материалов, инфицированных или потенциально инфицированных дикими полиовирусами, должны быть полными, включать сведения о происхождении материала, источнике, дате сбора, количестве, расположении в холодильнике;
- материалы, инфицированные или потенциально инфицированные дикими полиовирусами, хранят в пластиковых пробирках с завинчивающимися крышками и непротекающих прочных контейнерах, переносят из холодильника в холодильник в непротекающих прочных вторичных контейнерах.
Приложение 1
Нормативные ссылки
1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан от 22 июля 1993г. № 5487-1.
2. Федеральный закон от 30 марта 1999г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
3. Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Утверждено постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. № 322.
4. Положение об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации. Утверждено постановлением Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. № 569.
5. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании. Утверждено постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 № 554.
6. Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней. СП 3.1.3.2.1379-03.
7. Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий. СП 1.1.1058-01.
8. Изменения и дополнения № 1 к СП 1.1.1058-01 - Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий. СП 1.1.2193-07.
9. Санитарно-эпидемиологические требования к организациям и осуществлению дезинфекционной деятельности. СП 3.5.1378-03.
10. Отраслевой стандарт. Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы (ОСТ 42-21-85)
11. Безопасность работы с микроорганизмами III-IУ групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. СП 1.3.2322-08.
12. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IУ групп патогенности. СП 1.2.036-95.
13. Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом. СП 1.3.1325-03.
14. Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом. СП 1.3.1.2690-07.
15. Приказ Минздрава России от 17 июля 2002 г. № 228 «О порядке проведения мероприятий по контролю при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора».
16. Приказ Минздравсоцразвития России от 19.04.2007 № 283. «Критерии оценки эффективности работы врача-педиатра, участкового».
17. Организация и проведение серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета против «управляемых» инфекций (дифтерия, столбняк, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит). МУ 3.1.1.1760-03.
18. Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика. МУ 3.1.1.2130-06.
19. Организация контроля за уровнем квалификации персонала вирусологических лабораторий по вопросам безопасности лабораторного хранения материала, инфицированного или потенциально инфицированного диким полиовирусом. МР № 0100-8607-07-34 от 23.08.2007 г.
20. Дезинфекция, предстерилизационная очистка и стерилизации изделий медицинского назначения . МУ № 287-113 от 30.12.03.
21. Контроль работы паровых и воздушных стерилизаторов. МУ 1516-5 от 28.02.91.
22. Использование электромагнитного излучения сверхвысокой частоты для обеззараживания инфекционных медицинских отходов. МР 02.007-06.
23. Методические указания № 11-16/03-06 по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях, утв. Минздравмедпромом России 28.02.95.
24. Инструкция по эксплуатации и контролю эффективности вентиляционных устройств на объектах здравоохранения, утв.Минздравом СССР 20.03.75.
25. Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности. МУ 1.3.1888-04.
26. Организация работы по обеспечению безопасного лабораторного хранения диких полиовирусов. МР 12.11.2001.
27. Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита, 4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005 г.
28. Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита. ВОЗ, Женева, 2005 г.
29. Глобальный план действий для обеспечения безопасного лабораторного хранения диких полиовирусов. ВОЗ, Женева, 2000 г.
30. Рекомендации по обеспечению безопасного лабораторного хранения дикого полиовируса. ВОЗ, Женева, 2000 г.
31.Руководство по лабораторной безопасности, 3-е издание. ВОЗ, Женева, 2004 г.
32.Национальный план действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации. Утвержден Минзравсоцразвитием 17.03.2006 г.
Приложение 2
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 304; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!