Подготовка фекальных проб для исследования в культуре клеток
До приготовления фекальной суспензии присланную в лабораторию «исходную» пробу делят пополам, одну часть используют для приготовления суспензии, другую хранят при минус 200С (для отправки в НЦ, для повторного исследования пробы в случае необходимости).
Для исследования в культуре клеток фекальные пробы обрабатывают хлороформом для удаления бактерий, грибков, цитотоксических липидов, для разъединения вирусных аггрегатов.
Для приготовления 20% фекальной суспензии устойчивые к хлороформу полиэтиленовые центрифужные пробирки ёмкостью 50 мл маркируют в соответствии с номером пробы. В каждую пробирку вносят 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) с антибиотиками (Приложение 3), 1 г стеклянных бусин и 1 мл хлороформа. В пробирку вносят 2 г фекальной пробы. Плотно закрывают центрифужную пробирку и тщательно встряхивают в течение 20 минут в механическом шейкере или вручную. Центрифугируют 20 минут при 1500 g в центрифуге с охлаждением. Надосадочную жидкость каждой пробы переносят в два маркированных флакона с винтовой крышкой. Если жидкость непрозрачна, обработку хлороформом повторяют. Суспензию из одного флакона используют для исследования, второй флакон хранят при минус 200С для отправки в НЦ, если это будет необходимо.
Пробы, отобранные с помощью ректальных «соломинок», готовят для исследования так же, как и фекальные пробы.
Приготовление проб, отобранных с помощью ректального тампона
|
|
|
Ёмкость, содержащую ректальный тампон в транспортировочной среде, тщательно встряхивают в механическом шейкере или вручную для того, чтобы фекальный материал перешёл в жидкость. Стерильным пинцетом плотно прижимают тампон к стенке ёмкости, отжимают жидкость, которую переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 20 минут при 1500g в центрифуге с охлаждением. Надосадочную жидкость осторожно переносят в два маркированных флакона и хранят при минус 200С.
Приготовление секционных проб
Из тканей ЦНС (головной мозг, продолговатый мозг, спинной мозг), помещённых в транспортировочную среду, готовят 10% суспензию в ФСБ с антибиотиками. Гомогенизируют в измельчителе, переносят жидкость в центрифужную пробирку и центрифугируют 20 минут при 1500g в центрифуге с охлаждением. Надосадочную жидкость осторожно переносят в два маркированных флакона и хранят при – 200С.
Участок толстой кишки вместе с содержимым используют для приготовления 20% суспензии и обрабатывают так же, как пробы фекалий.
Выделение и идентификация вирусов
Клеточные линии, рекомендуемые для выделения полиовирусов. Основные принципы работы
|
|
|
Для выделения полиовирусов из проб используют перевиваемые линии культур клеток RD и L20B.
RD – клетки рабдомиосаркомы человека, чувствительны к полиовирусам, вирусам группы ЕСНО, некоторым вирусам группы Коксаки А (за исключением А1, А19, А22), энтеровирусам 68-71. Иногда вирусы группы Коксаки В проявляют цитопатический эффект (далее – ЦПЭ) на клетках RD. L20B – линия мышиных клеток (L-клеток), способная экспрессировать рецептор полиовируса. Клетки L20B избирательно чувствительны к полиовирусам, которые вызывают в них характерный ЦПЭ. Ряд вирусов - аденовирусы, реовирусы, некоторые НПЭВ (Коксаки А 2-6, 8, 10, 14) могут вызывать ЦПЭ в этих клетках, однако он значительно отличается от вызываемого полиовирусом. Использование комбинации этих двух клеточных линий обеспечивает высокую чувствительность и специфичность выявления полиовируса. Использование культуры клеток НЕр-2 (Cincinnati), чувствительной к полиовирусам и вирусам группы Коксаки В, не является обязательным. Однако, исключение их из работы может привести к потере НПЭВ, в частности Коксаки В.
Культуры клеток должны быть получены по запросу из официальных источников (для НЦ - из лабораторий Глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ, для РЦ – из НЦ). После получения клеток лаборатория создаёт банк клеток. Запас каждой линии культуры клеток должен составлять не менее 12 ампул, которые используются по мере необходимости для создания «рабочей» линии клеток. Для сохранения чистоты, аутентичности и стабильности клеточных культур следует заменять «рабочую» линию после 3-х месяцев или 15 пассажей культивирования в лаборатории. Все манипуляции с культурами клеток фиксируют в рабочем журнале, обозначая тип клеток, номер пассажа, дату посева и все смены среды.
|
|
|
Все работы с неинфицированными культурами клеток проводятся в отдельном боксированном помещении, расположенном в «неинфекционной зоне» лаборатории, в БЗУ 2 класса безопасности. Для избежания перекрёстной контаминации между различными типами клеточных культур никогда не работают одновременно с несколькими культурами клеток. Все неинокулированные культуры клеток следует считать потенциально опасными, поэтому после окончания работы все культуральные жидкости и культуры обеззараживают автоклавированием.
При работе с культурами клеток, создании клеточных банков следует руководствоваться приёмами в соответствии с «Руководством по лабораторным исследованиям полиомиелита», (4-е издание, ВОЗ, 2005).
|
|
|
Для контроля чувствительности клеток к полиовирусам проводят ежеквартальное титрование вакцинных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3 (референс-штаммы) на каждой из культур клеток после 8-10 пассажей (Приложение 5, рис. 1). Если титр референс-штаммов не отличается от установленного ранее или отличается в пределах ± 0,5 lg, можно считать, что чувствительность клеток не понизилась. Превышение ожидаемого значения на 0,5 lg или более может быть связано с погрешностями в приготовлении разведений вируса. Снижение титра по сравнению с ожидаемым на 0,5 lg или более может указывать на снижение чувствительности клеток. В этом случае выполняют титрование новой порции референс-штамма. Одновременно проверяют возможные изменения в условиях культивирования клеток. Если низкий титр воспроизводится при титровании новой порции, а изменений в условиях культивирования клеток не выявлено, используемые клетки необходимо заменить из клеточного банка лаборатории (или получить по запросу в НЦ или РЦ).
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 221; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!