Выделение полиовирусов, других (неполио)энтеровирусов
Микроскопируют культуры с недавно сформированным монослоем клеток RD и L20B, выращенные на поверхности пластиковых флаконов площадью 25 см2 или пробирок (нормальный монослой формируется в течение 2-3 дней после посева клеток). Ростовую среду, содержащую сыворотку, заменяют поддерживающей средой (8-10,0 мл на флакон, 1,0-1,5 мл на пробирку). Флаконы/пробирки маркируют, указывая номер пробы, дату инокуляции, номер пассажа. Для исследований одной пробы используют по 1 флакону каждой культуры или по 2 пробирки на один пассаж. По 1 флакону/пробирке с каждым типом клеток оставляют незаражёнными в качестве отрицательного контроля.
Флаконы/пробирки с клетками обеих линий инокулируют одновременно, внося заражающий материал из расчёта 0,4-0,6 мл во флакон или 0,2 мл в пробирку. Культуры инкубируют при 360С, ежедневно микроскопируют, наблюдая за появлением ЦПЭ.
Результаты наблюдений за инокулированными и контрольными культурами регистрируют в рабочем журнале: развитие ЦПЭ, охватывающего 25% монослоя, обозначают как 1+, 25-50% - 2+, 50-75% - 3+, 75-100% - 4+. Быстрая дегенерация клеток в течение одного-двух дней после инокуляции может быть вызвана неспецифической токсичностью пробы. Культуры, проявившие признаки неспецифической дегенерации, замораживают при минус 200С, оттаивают и пассируют на клетках того же типа. Если признаки токсичности проявляются снова, возвращаются к исходному экстракту пробы, разводят его 1:10 в ФСБ и повторяют процесс инокуляции как описано выше. В случае бактериальной контаминации среды, возвращаются к исходному экстракту пробы, вновь обрабатывают его хлороформом, повторяют процедуры инокуляции.
|
|
|
После появления характерного для энтеровирусов ЦПЭ, оцененного как 4+, прекращают инкубацию, культуру замораживают при минус 200С для последующего пассажа. При появлении ЦПЭ 4+ материал второго пассажа используют для идентификации вируса и проведения ВТД.
Если в первом пассаже ЦПЭ в течение 7 дней не проявился, проводят «слепой» пассаж и наблюдают культуры в течение 7 дней. Общий срок наблюдения за культурами с отрицательным результатом должен составлять не менее 14 дней, после чего их уничтожают, а результат исследования образца расценивается как «отрицательный».
При наличии ЦПЭ на клетках RD, но отсутствии на клетках L20B после 14 дней наблюдения, проводят пассирование культурального материала, полученного на уровне 2-го пассажа на клетках RD, на культуре L20B.
Некоторые пробы фекалий содержат вирусы, вызывающие ЦПЭ в клетках L20B, но не относящиеся к энтеровирусам (например, отдельные рео- и аденовирусы). Во многих случаях вызываемый ими ЦПЭ чётко отличается от ЦПЭ, свойственного энтеровирусам. Присутствие такого агента в пробе регистрируется. Следует предпринять попытку идентифицировать агент, чтобы исключить присутствие полиовируса. При получении неопределённых или трудно интерпретируемых результатов, выделенный агент следует отправить в НЦ.
|
|
|
Идентификация выделенных полиовирусов.
Идентификацию выделенных штаммов полиовирусов проводят в реакции нейтрализации инфекционности на культуре клеток микрометодом. В основе реакции нейтрализации лежит взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной антисывороткой (или смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД50, смешивают в равном объёме с диагностическими сыворотками в лунках планшета для микронейтрализации, инкубируют 1 час при 360С, добавляют суспензию клеток, помещают в термостат, проводят ежедневное микроскопирование до получения окончательного результата идентификации (как правило, в течение 5 суток).
Для идентификации используют сыворотки к полиовирусам типа 1, 2 и 3, которые распространяются ВОЗ для лабораторий, включённых в Глобальную лабораторную сеть по диагностике полиомиелита. Могут быть использованы сыворотки к полиовирусам типа 1, 2 и 3, зарегистрированные и разрешённые в Российской Федерации к применению в установленном порядке. Подготовку рабочих разведений сывороток/смесей сывороток проводят в соответствии с инструкциями производителя.
|
|
|
Проведение теста микронейтрализации, интерпретацию результатов выполняют в соответствии с «Руководством по лабораторным исследованиям полиомиелита», (4-е издание, ВОЗ, 2005).
Типирование выделенного вируса проводят на той культуре, на которой он выделен. Если вирус выделен и на клетках RD, и на клетках L20B, проводят идентификацию на обеих культурах, при этом в первую очередь исследуют штамм, выделенный на L20B, для быстрого получения наиболее важного результата.
Выделенные штаммы полиовирусов (и исходные образцы фекалий, из которых они были выделены) в течение 7 дней после идентификации направляют в НЦ для проведения ВТД. Если при проведении идентификации на разных культурах клеток были получены одинаковые результаты, то в НЦ отправляют изолят, выделенный на какой-то одной культуре (предпочтение отдаётся культуре RD). При выявлении смеси полиовирусов в НЦ отправляют неразделённую смесь или разделённые штаммы для подтверждения результатов и ВТД.
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 215; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!