Вопрос-96 Sanger NGS Микрочипы
Метод Сэнгера —метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году[, за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году.
Принцип метода[править | править код]
В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:
праймер — небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;
небольшое количество радиоактивно меченного дезоксинуклеотида (например, [32P]-дАТФ), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции;
смесь трёх дезоксинуклеотидов в оптимальных для протекания реакции концентрациях, четвёртый дезоксинуклеотид в более низкой концентрации и дидезоксипроизводное четвёртого нуклеотида.
У диДнк отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят радиоавтографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК].
|
|
|
Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в форме ДНК с помощью обратной транскрипции.
NGS
Секвенирование нового поколения —техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.
|
|
|
Микрочип – это:микроскопическое количество молекул зонда, прикреп
ленное к поверхности носителя или помещенное внутрь него (как в случае с гелевыми чипами,
1-флуоресцентно меченая ДНК зонда,
2-набор реактивов для мечения, гибридизации и детекции сигнала.
Собственно микрочиповый анализ включает в себя следующие этапы:
1-Пробоподготовка анализируемого материала:
2-выделение и очистка анализируемой ДНК (или РНК)
зонда;
3-амплификация ДНК (или РНК) зонда с одновременным мечением флуоресцентным красителем.
Гибридизация амплифицированного, флуоресцентномеченого зонда с ДНКпробами, содержащимися на микрочипе.
1-Детекция сигнала.
2-Обсчет полученных данных.
Технология микрочипов может быть использована в клинической диагностике для определения 1-вирусов и микроорганизмов, гормонов, аллергенов, наркотиков,
2-любыхбиоактивных веществ в любых малых концентрациях;
3-в биологических и медико(биологических исследованиях;
4-в криминалистике;
Вопрос-97 выделение ДНК
Методы выделения ДНК
|
|
|
ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе.
Методика выделения ДНК зависит от состава и характера используемого источника (ткани животных или растений, микроорганизмы, вирусы). Для лабораторного и промышленного получения ДНК обычно используют вилочковую железу теленка, а также сперму (молоки) рыб, селезенку млекопитающих, ядерные эритроциты птиц.
Препараты ДНК, получаемые обычно в виде натриевой соли ДНК, имеют вид белых волокон. Для сохранения нативных свойств ДНК обработку тканей и клеток проводят на холоду, по возможности быстро, в условиях, исключающих или уменьшающих действие дезоксирибонуклеаз, как правило, содержащихся в тканях и вызывающих ферментативный распад ДНК. Помимо сохранения нативных свойств, важнейшей задачей является очистка ДНК от других веществ, в первую очередь — от белков и РНК. В связи с этим методы получения ДНК различаются главным образом способами депротеинизации и очистки препаратов от примесей РНК. Для этих целей применяют обработку клеток и тканей различными детергентами, фенолами и другими депротеинизирующими агентами.
|
|
|
При получении ДНК из животных и растительных тканей чаще всего предварительно изолируют фракцию клеточных ядер или выделяют дезоксирибонуклеопротеиды, отмывая их солевыми растворами в физиологических концентрациях в присутствии ЭДТА или других соединений, связывающих двухвалентные катионы, необходимые для проявления ферментативной активности дезоксирибонуклеаз.
Для получения ДНК из бактерий обычно пользуются методом Мармура. который заключается в отмывании бактериальной массы Этот метод в различных модификациях также успешно применяют для получения ДНК из животных и растительных тканей и изолированных клеточных структур, например, митохондрий.
Весь процесс экстракции ДНК состоит из цепочки последовательных, связанных друг с другом этапов:Набор для выделения ДНК
1. Быстрое разрушение клеток (лизис).
2. Освобождение рабочего материала от клеточного содержимого (органелл) и мембран.
3. Денатурация белков, их экстрагирование с помощью ферментов.
4. Извлечение искомых нитей ДНК, взаимодействие их с этиловым спиртом с целью выделения осадка.
5. Растворение полученной твердой фазы в буферной жидкости.
Методов выделения ДНК существует множество.
* Экстракция под действием органических растворителей;
* Экстракция с помощью гель-фильтрации;
* Экстракция с помощью магнитных частиц;
* Экстракция на бумажных фильтрах;
* Ионообменные смолы
ВОпрос-98 ПЦР
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 628; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!